Name: electrophysiological investigations of retinogeniculate and corticogeniculate synapse function
Uploaded: 2019-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) all'interno del Centro di ricerca collaborativa (SFB) 1134 "Ensemble funzionali" (J.v.E. e X.C.) e dal Research Grant EN948/1-2 (J.v.E.).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal gruppo governativo di vigilanza sugli esperimenti sugli animali della Renania-Palatinato.
1. Soluzioni
<ol><li>Soluzione di dissezione<ol>
<li>Per ridurre l'eccitotossicità, preparare una soluzione a base di colina da utilizzare durante la dissezione come qui presentato (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro di colina, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, e 25 glucosio. ...

<ol>
	<li>Guido, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+form,+and+function+of+the+mouse+visual+thalamus.">Development, form, and function of the mouse visual thalamus.</a> Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).</li><li>Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paying+attention+to+the+thalamic+reticular+nucleus.">Paying attention to the thalamic reticular nucleus.</a> Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).</li><li>Turner, J. P., Salt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sensory+and+corticothalamic+excitatory+inputs+to+rat+thalamocortical+neurones+in+vitro.">Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro.</a> The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).</li><li>Lindstrom, S., Wrobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+dependent+corticofugal+excitation+of+principal+cells+in+the+cat's+dorsal+lateral+geniculate+nucleus.">Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus.</a> Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).</li><li>Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+pulse+facilitation+of+corticogeniculate+EPSCs+in+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+of+the+rat+investigated+in+vitro.">Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro.</a> The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).</li><li>Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+of+a+local+circuit+neurone+in+lateral+geniculate+nucleus+of+the+cat.">Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat.</a> Nature. 317, 618-621 (1985).</li><li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+patterns+govern+synapse-specific+AMPA+receptor+trafficking+between+deliverable+and+synaptic+pools.">Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools.</a> Neuron. 62, 84-101 (2009).</li><li>Chen, C., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+remodeling+of+the+retinogeniculate+synapse.">Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 28, 955-966 (2000).</li><li>Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+signal+filtering+at+a+multisynapse+contact.">Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).</li><li>Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fuzzy+Logic+of+Network+Connectivity+in+Mouse+Visual+Thalamus.">The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus.</a> Cell. 165, 192-206 (2016).</li><li>Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-spike+interactions+and+synaptic+efficacy+of+retinal+inputs+to+the+thalamus.">Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus.</a> Nature. 395, 384-387 (1998).</li><li>Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thalamus. , (1997).</li><li>Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+alignment+of+feedback+effects+from+visual+cortex+to+thalamus.">Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus.</a> Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).</li><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).</li><li>Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+receptor+desensitization+and+saturation+to+plasticity+at+the+retinogeniculate+synapse.">Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 33, 779-788 (2002).</li><li>Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAMP44+modulates+integration+of+visual+inputs+in+the+lateral+geniculate+nucleus.">CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus.</a> Nature Communications. 9, 261 (2018).</li><li>Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+distinct+classes+of+relay+cells+exhibit+regional+preferences+in+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+of+the+mouse.">Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).</li><li>von Engelhardt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAMP44:+a+brain-specific+protein+attenuating+short-term+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus.">CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus.</a> Science. 327, 1518-1522 (2010).</li><li>Khodosevich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpressed+auxiliary+subunits+exhibit+distinct+modulatory+profiles+on+AMPA+receptor+function.">Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function.</a> Neuron. 83, 601-615 (2014).</li><li>Farrow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+subunits+of+the+CKAMP+family+differentially+modulate+AMPA+receptor+properties.">Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties.</a> eLife. 4, e09693 (2015).</li><li>Rafols, J. A., Valverde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+in+the+mouse.+A+Golgi+and+electron+microscopic+study.">The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study.</a> The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).</li><li>Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+synaptic+currents+increase+relay+neuron+firing+at+the+developing+retinogeniculate+synapse.">Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).</li><li>Hooks, B. M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+spontaneous+and+visual+activity+in+remodeling+of+the+retinogeniculate+synapse.">Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 52, 281-291 (2006).</li><li>Liu, X., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+for+AMPA+and+NMDA+receptors+in+transmission+at+the+immature+retinogeniculate+synapse.">Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse.</a> Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).</li><li>Govindaiah, G., Cox, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+differentially+regulate+GABAergic+inhibition+in+thalamus.">Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).</li><li>Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+the+Brakes:+Cellular+and+Synaptic+Mechanisms+that+Regulate+Thalamic+Oscillations.">Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations.</a> Neuron. 92, 687-704 (2016).</li><li>Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(B)+and+NMDA+receptors+contribute+to+spindle-like+oscillations+in+rat+thalamus+in+vitro.">GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).</li><li>Kulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+localization+of+GABA(B)+receptors+relative+to+synaptic+sites+in+the+rat+cerebellum+and+ventrobasal+thalamus.">Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus.</a> The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).</li><li>Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+low-threshold+spike+activation+in+relay+neurons+of+the+cat+lateral+geniculate+nucleus.">Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).</li><li>Armstrong, C. M., Gilly, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+resistance+and+space+clamp+problems+associated+with+whole-cell+patch+clamping.">Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping.</a> Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).</li><li>White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+in+persistent+inward+currents+generated+by+space-clamp+errors:+a+modeling+study.">Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study.</a> Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).</li><li>Clay, J. R., Shlesinger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effects+of+cesium+ions+on+potassium+channel+currents+in+biological+membranes.">Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes.</a> Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).</li></ol>

Descriviamo un protocollo migliorato basato su un metodo pubblicato in precedenza3, che consente di sforare l'alta probabilità di rilascio di sinapsi retinogeniche e bassa probabilità di rilascio di sinapsi corticogeneulate dalla stessa fetta. Questo è di grande importanza poiché questi due ingressi interagiscono tra loro per modulare la trasmissione del segnale visivo: gli ingressi retinogeniculati sono la principale unità eccitatoria dei neuroni relè, mentre gli input corticothalamici funz...

I neuroni relè del nucleo genetico laterale integrano e trasmettono informazioni visive alla corteccia visiva. Questi neuroni ricevono l'input eccitatorio dalle cellule gangliari tramite sinapsi retinogeniche, che forniscono la principale unità eccitatoria per i neuroni relè. Inoltre, i neuroni relè ricevono input eccitatori dai neuroni corticali tramite sinapsi corticogeni. Inoltre, i neuroni relè ricevono input inibitori da interneuroni locali e neuroni GABAergici del nucleo reticularis thalami1. Il nucleo reticularis thalami è presente come uno scudo tra talamo e corteccia tale che le fibre che proiettano dalla corteccia al talamo e nella direzione opposta devono passare attraverso il nucleo reticularis thalami2.
Gli input retinogenici e gli ingressi corticogenici visualizzano proprietà sinaptiche distinte3,4,5,6,7,8. Ingressi retinogenici formano terminali di grandi dimensioni con più siti di rilascio9,10. Al contrario, gli ingressi corticogenici visualizzano piccoli terminali con siti a rilascio singolo7. Inoltre, le sinapsi retinogeniche guidano in modo efficiente i potenziali di azione dei neuroni relè, nonostante che imredditivi solo il 5-10% di tutte le sinapsi sui neuroni del relè3,8,11. Le sinapsi corticogenice, d'altra parte, fungono da modulatore delle trasmissioni retinogeniculate controllando il potenziale della membrana dei neuroni relè12,13.
Questi due principali input eccitatori per i neuroni relè sono anche funzionalmente diversi. Una differenza importante è la depressione a breve termine delle sinapsi retinogeniche e la facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogenice3,5,8. La plasticità a breve termine si riferisce a un fenomeno in cui la forza sinaptica cambia quando la sinapsi è ripetutamente attiva entro un periodo di tempo di pochi millisecondi a diversi secondi. La probabilità di rilascio sinaptico è un fattore importante alla base della plasticità a breve termine. Le synapsi, con una bassa probabilità di rilascio iniziale, mostrano facilitazione a breve termine a causa dell'accumulo di Ca2 e nella presynapse e di conseguenza un aumento della probabilità di rilascio viene osservato su attività ripetute. Al contrario, le sinapsi con alta probabilità di rilascio di solito mostrano depressione a breve termine a causa dell'esaurimento delle vesciche pronte e riutilizzabili14. Inoltre, la desensibilizzazione dei recettori post-sinaptici contribuisce alla plasticità a breve termine in alcune sinapsi di probabilità ad alto rilascio8,15. Alta probabilità di rilascio e desensibilizzazione dei recettori dell'acido isossiale-5-metil-4-isoxalepropionici (AMPA) che contribuiscono alla depressione a breve termine prominente delle sinapsi retinogeniche. Al contrario, la probabilità a basso rilascio è alla base della facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogeni.
Nei topi, il tratto ottico entra nel nucleo genulato laterale dorsale (dLGN) dal sito caudolaterale, mentre le fibre corticogeniulate entrano nel dLGN rostroventrallyamente. La distanza tra i due ingressi consente di sforare le singole proprietà di due input eccitatori molto diversi che incidono sulla stessa cella. Qui, costruiamo e miglioriamo un metodo di dissezione descritto in precedenza in cui le fibre retinogeniculate e corticogeniule sono conservate nelle fette acute del cervello3. Descriviamo quindi lo studio elettrofisiologico dei neuroni relè e la stimolazione delle fibre retinogenulate e corticogeniulate con elettrodi di stimolazione extracellulare. Infine, forniamo un protocollo per il riempimento dei neuroni relè con biocitina e successiva analisi anatomica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="614">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Amplifier&#160;</td>
			<td style="width:98px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:123px;">EPC 10 USB Double patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">B4261-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.02382.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">choline chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C1879-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:98px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CsCl</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.02038.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cs-gluconate</td>
			<td style="width:98px;">Self-prepared</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-600&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M5644-50MG</td>
			<td>methoxyverapamil hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-APV&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Biotrend&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BN0085-100</td>
			<td style="width:172px;">NMDA-receptor antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Digital camera for microscope</td>
			<td style="width:98px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:98px;">SERVA</td>
			<td style="width:123px;">11290.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Forene</td>
			<td style="width:98px;">Abbvie</td>
			<td style="width:123px;">2594.00.00</td>
			<td style="width:172px;">isoflurane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:98px;">ROTH</td>
			<td style="width:123px;">9105.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">High Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:98px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">A385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Micromanipulators</td>
			<td style="width:98px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:123px;">SM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Miroscope</td>
			<td style="width:98px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:98px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:98px;">ROTH</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:98px;">EMSURE</td>
			<td style="width:123px;">1.06329.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette</td>
			<td style="width:98px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:123px;">1807502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Puller</td>
			<td style="width:98px;">Sutter&#160;</td>
			<td style="width:123px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">razor blade&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Personna&#160;</td>
			<td>60-0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Semiautomatic Vibratome</td>
			<td style="width:98px;">Leica&#160; Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">SR 95531 hydrobromide&#160;</td>
			<td style="width:98px;">Biotrend&#160;</td>
			<td style="width:123px;">AOB5680-10</td>
			<td style="width:172px;">GABAA-receptor antagonist&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological investigations of retinogeniculate and corticogeniculate synapse function

Il nucleo genetico laterale è la prima stazione di relè per le informazioni visive. I neuroni relè di questo nucleo talamico integrano l'input dalle cellule gangliari della retina e lo proiettano nella corteccia visiva. Inoltre, i neuroni relè ricevono eccitazione dall'alto verso il basso dalla corteccia. I due principali input eccitatori per i neuroni relè differiscono in diversi aspetti. Ogni neurone relè riceve input solo da poche sinapsi retinogeniche, che sono grandi terminali con molti siti di rilascio. Ciò si riflette nell'eccitazione relativamente forte, i neuroni relè ricevono, dalle cellule gangliari della retina. Le sinapsi corticogenie, al contrario, sono più semplici con pochi siti di rilascio e una forza sinaptica più debole. Le due sinapsi differiscono anche nella loro plasticità sinaptica a breve termine. Le sinapsi reticolatiche esologiano hanno un'alta probabilità di rilascio e di conseguenza mostrano una depressione a breve termine. Al contrario, le sinapsi corticogenie hanno una bassa probabilità di rilascio. Le fibre corticogeniche attraversano i nuclei talamici reticolari prima di entrare nel nucleo genetico laterale. Le diverse posizioni del nucleo talamico talamico reticolare (rostrally dal nucleo genetico laterale) e del tratto ottico (ventro-lateralmente dal nucleo genetico laterale) consentono di stimolare sinaple corticogenio o retinogenica separatamente con elettrodi di stimolazione extracellulare. Questo rende il nucleo genetico laterale un'area cerebrale ideale in cui due sinapsi eccitatorie con proprietà molto diverse che incidono sullo stesso tipo di cellula, possono essere studiate contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per studiare la registrazione dai neuroni relè ed eseguire un'analisi dettagliata della funzione di sinapsi retinogenica e corticogenica nelle fette cerebrali acute. L'articolo contiene un protocollo passo-passo per la generazione di fette cerebrali acute del nucleo genetico laterale e passaggi per la registrazione dell'attività dai neuroni relè stimolando separatamente il tratto ottico e le fibre corticogenice.

La preparazione della fetta di dLGN contenente le vie retinogenica e corticogenica è mostrata in base a un obiettivo 4x (Figura 2). Gli assoni delle cellule gangliari retiniche si uniscono nel tratto ottico (Figura 2). La pipetta stimolante è stata posizionata sul tratto ottico per indurre la corrente mediata dalla sinapsi retinogenica (Figura 2A) e sul nucleo reticolari thalami per indurre la corr...

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Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Qui presentiamo i protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo geniculato laterale e l'indagine elettrofisiologia del genicolo retinico e della funzione sinapsi genicolata corticale. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche entrano nel nucleo geniculato laterale lontano dagli ingressi corticali. Ciò consente le stimolazioni separate del geniculato retinale e delle sinapsi genicolate corticali, che hanno proprietà funzionali molto diverse.Per iniziare questa procedura, preparare due camere a fette, una riempita con 100 millilitri della soluzione di dissezione e l'altra con 100 millilitri di soluzione di registrazione. Mettere i due becher in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e far bollire le soluzioni con carbogeno per almeno 15 minuti prima della dissezione. Quindi riempire un becher di plastica con 250 millilitri di soluzione di dissezione quasi ghiacciata e bollarlo con carbogeno per almeno 15 minuti prima dell'uso.Quindi riempire una piastra di Petri di plastica con la soluzione di dissezione fredda per la dissezione cerebrale. Posizionare un pezzo di carta da filtro nel coperchio della piastra di Petri e riempirlo con una piccola quantità di soluzione di dissezione. Successivamente raffreddare la camera di dissezione del vibratoma.Tagliare la pelle della testa dal caudale alla nasale e tenerla aperta con le dita per esporre il cranio. Per ottenere il forebrain, tagliare prima il cranio lungo la linea mediana posteriore/anteriore. Quindi tagliare altre due volte attraverso la sutura coronale e la sutura lambdoide.Rimuovere il cranio tra la sutura coronale e la sutura lambdoide per esporre il cerebro. Tagliare il bulbo olfattivo e separare il forebrain dal cervello medio con una lama fine. Rimuovere il cervello dal cranio con una spatola sottile e posizionarlo su una carta da filtro nel coperchio della piastra di Petri.Per preservare l'integrità degli input sensoriali e corticali al nucleo geniculato laterale dorsale nella fetta cerebrale, separare i due emisferi con un taglio parasagittale con un angolo di tre-cinque gradi. Successivamente asciugare i piani laterale mediali dei due emisferi posizionandoli su una carta da filtro. Quindi incollali sullo stadio di taglio con un angolo da 10 a 25 gradi dal piano orizzontale.Posizionare lo stadio al centro del vassoio tampone metallico e versare delicatamente il resto della soluzione di dissezione ghiacciata nel vassoio tampone. Eseguire questo passaggio con attenzione, poiché versare troppo duramente potrebbe rimuovere il cervello incollato. Quindi mantenere il vassoio tampone nel vassoio pieno di ghiaccio per mantenere la bassa temperatura durante la dissezione.Sezione 250-micrometro fette con una lama rasoio ad una velocità di 0,1 millimetri al secondo e un'ampiezza di un millimetro. Trasferire le fette nella camera di tenuta riempita con soluzione di dissezione ossigenata a 34 gradi Celsius per circa 30 minuti, quindi lasciare che le fette si riprendano nella soluzione di registrazione a 34 gradi Celsius per altri 30 minuti. Dopo il recupero, rimuovere la camera di tenuta delle fette dal bagno d'acqua e mantenere le fette a temperatura ambiente fino a quando non viene utilizzata negli esperimenti.In questa procedura, tirare le pipette di registrazione utilizzando capillari di vetro borosilicato e un estrattore di filamento. Quindi tirare le pipette stimolanti utilizzando lo stesso protocollo, ma rompere leggermente la punta dopo aver tirato per aumentare il diametro. Successivamente riempire le pipette di registrazione con soluzione intracellulare e biocitina e riempire le pipette stimolanti con soluzione di registrazione.Quindi posizionare le fette nella camera di registrazione e perfonderle continuamente con una soluzione di registrazione ossigenata a temperatura ambiente. Visualizza le fette con un microscopio verticale dotato di microscopia video IR-DIC. Controllare tutte le fette e selezionare quelle che visualizzano tratti ottici intatti.Posizionare la pipetta di stimolazione sulla fetta prima di rattoppare la cella con una pipetta di registrazione. Per indagare le sinapsi genicolate retiniche, posizionare la pipetta stimolante direttamente sul tratto ottico dove sono raggruppate le fibre di assone provenienti dalle cellule gangliari retiniche. Per analizzare le sinapsi genicolate corticali, posizionare l'elettrodo stimolante sul nucleo reticolare thalami, che è rostroventralmente adiacente al nucleo geniculato laterale dorsale.Una volta che la pipetta di registrazione è immersa nella soluzione di registrazione, applicare un passo di cinque millivolt per monitorare la resistenza della pipetta. Impostate il potenziale di tenuta su zero millivolt e annullate il potenziale di offset in modo che la corrente di tenuta sia zero picoampere. Avvicinati alla cella con una pipetta di registrazione mentre applichi una pressione positiva.Quando la pipetta è a diretto contatto con la membrana cellulare, rilasciare la pressione positiva e impostare il potenziale di tenuta a meno 70 millivolt. Quindi applicare una leggera pressione negativa per consentire alla membrana cellulare di attaccarsi alla pipetta di vetro in modo tale che si forma una guarnizione gigaohm. Compensate la capacità della pipetta e aprite la cella applicando impulsi di pressione negativi.Per studiare la funzione sinaptica, applicare impulsi di corrente di 0,1 millisecondi tramite la pipetta di stimolazione. Monitorare continuamente la resistenza della serie applicando un passo di cinque millivolt. La resistenza della serie può essere stimata dividendo cinque millivolt per l'ampiezza di picco della corrente evocata.Utilizzare solo le celle con una resistenza in serie inferiore a 20 megaohms per l'analisi. Per l'etichettatura della biocitina, mantenere la configurazione a cellule intere per almeno cinque minuti per consentire la diffusione della biocitina nei dendriti distale. Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dalla cella in modo che il soma non venga distrutto.Preparare una piastra di coltura cellulare di 24 po '. Riempire ogni bene con 300 microlitri del 4%PFA. Fare attenzione a non contaminare nulla con PFA che sarà a contatto con le fette da registrare.Trasferire le fette dalla camera di registrazione alla piastra contenente PFA con una pipetta di gomma e fissarle durante la notte. Il giorno dopo, sostituire il PFA con PBS. Mantenere le sezioni in PBS a quattro gradi Celsius per l'elaborazione futura.Per macchiare le cellule, lavare le fette con PBS fresco tre volte. Bloccare i siti di legame aspecifici incubando le fette nella soluzione di blocco per due ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi scartare la soluzione di blocco e incubare le fette con streptavidina Alexa 568 diluita nella soluzione di blocco a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale.Il giorno successivo, scartare la soluzione anticorpale e lavare le fette tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi lavare le fette con acqua del rubinetto prima del montaggio. Posizionare le fette di un mouse su uno scivolo di vetro.Assicurarsi che le celle macchiate siano presenti sulla superficie superiore delle fette. Assorbire l'acqua intorno alle fette con i tessuti, quindi lasciare asciugare le fette per circa 15 minuti. Successivamente applicare due gocce di mezzo di montaggio su ogni fetta e montare uno scivolo di copertura sullo scivolo senza produrre bolle d'aria.Conservare le sezioni etichettate a quattro gradi Celsius dopo averle visualizzate con un microscopio confocale. Questa immagine IR-DIC mostra il soma di un neurone relè del nucleo geniculato laterale dorsale con una punta della pipetta patch. La colorazione della biocitina ci permette di avere una visione del neurone registrato.Diversi dagli internaurioni, che hanno morfologia bipolare, i neuroni relè hanno pergolati dendritici multipolari contenenti più di tre dendriti primari. È stata quindi generata la ricostruzione tridimensionale di un neurone relè etichettato biocitina, che mostra un'architettura dendritica radialmente simmetrica. Mantieni gli input geniculati retinali e gli input geniculati corticali nelle stesse fette cerebrali sono più importanti in questo protocollo.Seguendo questa procedura, possiamo, ad esempio, studiare anche gli input inibitori dal nucleo reticolare thalami sui neuroni del nucleo geniculato laterale dorsale. Ricordarsi di indossare guanti quando si riparano le fette cerebrali con PFA, poiché la PFA è pericolosa.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Le misurazioni elettrofisiologiche e Analisi di nocicezione nei neonati umani

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

Un metodo per la sistematica elettrochimici ed elettrofisiologiche di valutazione dei neurali registrazione elettrodi

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...