Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

نشكر اريك L فان نوستراند وجين دبليو يو للتوجيه المفيد مع البروتوكول الأصلي. وقد تم دعم K.Z. من قبل برنامج المفتاح الوطني R & D من الصين (2016YFA0500902, 2018Yبرشلونه 1003500), والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). وقد دعمت L.Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502 ، 31871503) وبرنامج مبتكره وريادة الاعمال في مقاطعه جيانغسو.

تمت الموافقة علي جميع التجارب الحيوانية التي أجريت من قبل لجنه جامعه نانجينغ الطبية. الذكور C57BL/6 وابقي الفئران تحت الظروف الضوئية الخاضعة للرقابة وزودت مع الطعام والماء.
1. حصاد الانسجه والاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة
<ol><li>موت ببطء 2 الكبار الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكر...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

مع زيادة فهم الدور العالمي لتقييديه تحت كل من السياقات البيولوجية والمرضية ، وقد استخدمت أساليب كليب علي نطاق واسع للكشف عن وظيفة الجزيئية من تقييديه20،32،33، 34,35. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تطبيقا م?...

تمثل الخصية الثديية نموذجا تنمويا ممتازا حيث يعمل برنامج تمايز الخلايا المعقدة بشكل دوري لإنتاج العديد من النطاف. وتكمن القيمة الفريدة لهذا النموذج في ظهور التعطيل العابر للحدود في مراحل معينه من النطاف ، وعاده عندما يحدث التنشيط الكروموسوم الجنسي الذي يصيب الجنس الواحد (MSCI)1و2 وعند الخضوع لجولة نطفه الضغط النووي الشديد اثناء التسبب في النطاف3. وتستلزم هذه الاحداث العابرة المتعاقبة تنظيم الجينات بعد العجز ، الذي تلعب فيه البروتينات الملزمة بالحمض الريبي النيبالي (تقييديه) دورا حاسما ، وتشكل الناسخة وتحافظ علي خصوبة الذكور.
لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي حسن النية من الفرد في الجسم الطبيعي ، ووضعت الطريقة ايمونوبريسيبيتيشن (كليب)4،5، استنادا إلى ولكن ابعد من الجيش الملكي النيبالي العادي ايمونوبريسيبيتيشن (RIP)6،7 ، من خلال ادراج الخطوات الرئيسية بما في ذلك الاشعه فوق البنفسجية (UV) الربط ، وغسل صارمة ونقل هلام لتحسين خصوصية الاشاره. وقد اثار التطبيق المتقدم لل CLIP مع التسلسل عاليه الانتاجيه اهتماما كبيرا في التنميط البروتين-RNA التفاعل في مستويات الجينوم علي نطاق واسع8. بالاضافه إلى الدراسات الوراثية علي وظيفة الملكية الخاصة ، وكانت هذه الأساليب البيوكيميائية التي تحدد التفاعل المباشر للبروتين الذاتية والحمض الريبي النيبالي لا غني عنها لتوضيح بدقه الأدوار التنظيمية RNA من تقييديه. علي سبيل المثال ، MOV10L1 هو الخصية الحمض الريبي النيبالية الخاصة المطلوبة للخصوبة الذكور والحمض الريبي المتفاعل (piRNA) بيوجينيسيس9. ومن المعروف MOV10 paralogue التي أعرب عنها بشكل مطلق ومتعددة الوظائف الحمض الريبي النيبالي الحلزوني مع الأدوار في جوانب متعددة من البيولوجيا rna10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18. من خلال توظيف التقليدية كليب-seq ، وجدنا ان MOV10L1 يربط وينظم الاوليه pirna السلائف للبدء في وقت مبكر pirna معالجه19،20، وان MOV10 يربط mrna 3 ' utrs وكذلك الحمض الريبي النيبالي غير الترميز الأنواع في الخلايا الجرثومية الخصية (البيانات لم تظهر).
ومع ذلك ، CLIP هو في الأصل اجراء شاقه ، المشعة تليها اعداد مكتبه التسلسل مع خسارة ملحوظة من العلامات كليب. في مقطع التقليدية ، يتم اعداد مكتبه cDNA باستخدام محولات ligated في كل من الأطراف RNA. بعد هضم البروتين ، تظل الجزيئات القصيرة المتداخلة المتداخلة مرتبطة بشظايا الحمض الريبي النيبالي. هذه العلامة المتقاطعة كتل جزئيا النسخ العكسي (rtase) التقدم خلال التوليف cdna ، مما ادي إلى اقتطاع cdna التي تمثل حوالي 80 ٪ من مكتبه cdna21،22. التالي ، يتم تسلسل أجزاء cDNA الناتجة عن RTase تجاوز موقع الارتباط التشعبي (القراءة). في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت مختلف النهج كليب ، مثل PAR-كليب ، iclip ، eclip و uvclap ، لتحديد مواقع تشعبي من تقييديه في الخلايا الحية. PAR-كليب ينطوي علي تطبيق الاشعه فوق البنفسجية 365 nm والنظير النيوكليوتيد فوتواكتيكتابل التالي يقتصر علي الخلايا الحية في الذبح ، ودمج النظير النيونوسيد في المستنسخات التي تم توليفها حديثا عرضه لإنتاج التحيز حيث يتفاعل الجيش الريبي النيبالي جسديا مع البروتين23،24. في iCLIP ، يتم ربط محول واحد فقط إلى اقصي 3 ' من شظايا RNA المرتبطة. بعد النسخ العكسي (RT) ، يتم الحصول علي كل من المقتطعة والقراءة من خلال cdnas بواسطة إينتراموليكولارلي الدوران وأعاده الخطي تليها تفاعل البلمره سلسله (PCR) التضخيم25،26. ومع ذلك ، فان كفاءه الدوران داخل الجزيئات منخفضه نسبيا. علي الرغم من ان البروتوكولات القديمة كليب بحاجه إلى وضع العلامات من الحمض الريبي النيبالي مع النظائر المشعة ، الاشعه فوق البنفسجية والتقارب تنقيه (uvCLAP) ، مع عمليه تنقيه تقارب ترادفية صارمة ، لا تعتمد علي النشاط الإشعاعي27. ومع ذلك, uvCLAP يقتصر علي الخلايا المستزرعة التي يجب ان يتم نقلها مع ناقلات التعبير التي تحمل 3x العلم-HBH العلامة لتنقيه تقارب ترادفي.
في eCLIP ، كانت المحولات ligated الاولي في 3 ' اقصي من الجيش النيبالي الريبي تليها RT ، والمقبل في الطرف 3 ' من cDNAs في وضع بين الجزيئية. التالي ، eCLIP قادره علي التقاط جميع المقتطعة والقراءة من خلال cDNA28. كما انه لا يقتصر علي وضع العلامات المشعة ، ولا علي استخدام الخطوط الخلوية استنادا إلى مبداها ، مع الحفاظ علي قرار أحادي النوكليوتيد.
هنا ، ونحن نقدم وصفا خطوه بخطوه لبروتوكول eCLIP تكييفها لخصيه الماوس. لفتره وجيزة ، يبدا هذا البروتوكول eCLIP مع الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة من أنابيب الخصية ، تليها الهضم RNase الجزئي والايمونوبريسيبيتيشن باستخدام مضادات البروتين الخاصة. المقبل ، والحمض الريبي الذي يرتبط بالبروتين هو deفوسفوفورلات ، ومحول هو ligated إلى نهايته 3 '. بعد بروتين هلام الكهربائي والنقل من هلام إلى غشاء ، يتم عزل الحمض الريبي النيبالي عن طريق قطع منطقه الغشاء من نطاق الحجم المتوقع. بعد RT ، محول الحمض النووي هو ligated إلى نهاية 3 ' من cDNA تليها التضخيم PCR. ويتم فحص المستنسخات الفرعية قبل التسلسل العالي الانتاجيه كمراقبه لجوده المكتبة. هذا البروتوكول فعال في تحديد الأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبط بالبروتين من تقييديه ، والتي تمثلها الخصيتين-التي تعبر عن الحمض الريبي النيبالي الحلزوني MOV10L1 و MOV10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

النطاف يحدد عمليه مرتبه للغاية من الذكور التمايز الخلايا الجرثومية في الثدييات. في الخصية ، والنسخ والترجمة غير مقترنة ، والتاكيد علي اهميه تنظيم ما بعد التحويل الجنسي للتعبير الجينات التي دبرها تقييديه. لتوضيح الأدوار الميكانيكية لل RBP ، يمكن استخدام منهجيه ايمونوبريسيبيتيشن (CLIP) للتقاط أهداف الجيش الملكي النيبالي المباشرة الذاتية وتحديد مواقع التفاعل الفعلية. المقطع المحسن (eCLIP) هو طريقه مطوره حديثا تقدم العديد من المزايا علي القصاصات التقليدية. ومع ذلك ، اقتصر استخدام eCLIP حتى الآن علي خطوط الخلايا ، داعيا إلى توسيع التطبيقات. هنا ، استخدمنا eCLIP لدراسة MOV10 و MOV10L1 ، اثنين من المعروفة الحمض الريبي النيبالي ملزمه الحلزونية ، في خصيه الماوس. كما هو متوقع ، ونحن نجد ان MOV10 في الغالب يربط إلى 3 ' المناطق غير المترجمة (UTRs) من mRNA و MOV10L1 يربط بشكل انتقائي إلى Piwi التفاعل الRNA (piRNA) السلائف المستنسخات. طريقه eCLIP الخاصة بنا تسمح بالتحديد السريع للأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبطة بمختلف تقييديه عن طريق التسلسل الصغير للمستنسخين التالي توفر المكتبات المؤهلة ، كامر قضائي للمضي في التسلسل العميق. وتحدد هذه الدراسة أساسا قابلا للتطبيق للحصول علي eCLIP في خصيه الثدييات.

ويبين الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4الإجراءات والنتائج الخاصة بالeclip. وكانت الفئران رحيم مع ثاني أكسيد الكربون وتم اجراء شق صغير في أسفل البطن باست?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

طريقه الربط المحسنة لايمونوبريسيبيتيشن (eCLIP) للتعرف الفعال علي الحمض الريبي المرتبط بالبروتين في خصيه الماوس

هنا ، نقدم بروتوكول eCLIP لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي الرئيسية للمرشحين الملكي في الخصية.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

البروتينات RNA ملزمة ضرورية لعلم وظائف الأعضاء الخلوية. الأهم من ذلك، يتم التعبير عن RBP بشكل كبير في جميع أنحاء تكوين الحيوانات المنوية وتم توثيقها جيدًا كمنظمين أساسيين بعد النسخ أثناء جميع مراحل الخلايا الجرثومية. وتحديد الأهداف الملزمة أمر بالغ الأهمية لتوضيح الأدوار الآلية لـ RBP.ويمثل هذا البروتوكول تطبيقاً مكيّفاً لطريقة eCLIP لالتقاط أهداف الحمض النووي الريبي المباشر الذاتية، وينشئ أساساً قابلاً للتطبيق لـ eCLIP في الخصية الثديية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها غير مشعة، وأقل كثافة للوقت، وتوفر نسبة أقوى من الإشارة إلى الضوضاء لأن المدخلات المتطابقة بالحجم ستكون بمثابة خلفية مناسبة للأهداف الحقيقية. وأخيرا، نعتقد أن التسلسل الصغير النطاق للركول الفرعية مفيد في متابعة التسلسل العميق.و سيكون شو تشيوشى زميلى هو الذى يظهر هذا الإجراء لبدء هذا الإجراء، حصاد حوالي 100 ملليغرام من الخصيصات من الفئران من العمر المناسب لكل تجربة المناعة. ضع الأنسجة في الثلج البارد PBS.باستخدام زوج من ملاقط ذات رؤوس دقيقة، قم بإزالة تونيكا ألبوجينا بلطف. إضافة ثلاثة ملليلترات من الجليد البارد PBS إلى طاحونة الأنسجة، واستخدام آفة الزجاج فضفاضة لtriturate الأنسجة بالقوة الميكانيكية خفيفة. بعد ذلك، نقل تعليق الأنسجة إلى طبق ثقافة الخلية، وإضافة الجليد البارد برنامج تلفزيوني يصل إلى ستة ملليلتر.يهز لوحة بسرعة بحيث يغطي السائل الجزء السفلي من الطبق بالتساوي. ربط التعليق على الجليد ثلاث مرات مع 400 ملليجول لكل سنتيمتر مربع في 254 نانومتر. تأكد من خلط التعليق بين كل تشعيع.ثم، وجمع تعليق في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 1، 200 مرة ز وعلى أربع درجات لمدة خمس دقائق. إزالة ناظر، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، نقل التعليق إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر.جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة ز و أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، والتخلص من فائقة. أولا، إضافة 125 ميكرولترات من البروتين الخرز المغناطيسي لكل عينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. وضع أنبوب على المغناطيس لفصل الخرز من الحل.بعد 10 ثوان ، قم بإزالة المابير ، وغسل الخرز مرتين بميليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة للجليد. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة التحلل الباردة مع 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة eCLIP. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.ثم، وغسل الخرز مرتين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة. للبدء، resuspend الكريات الأنسجة في ملليلتر واحد من عازلة تحلل الباردة التي تحتوي على 22 ميكرولترات من 50x EDTA خالية من البروتين المانع كوكتيل و 11 ميكرولترات من مثبط RNase. الحفاظ على عينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.Sonicate كل عينة كما هو موضح في بروتوكول النص. المقبل، إضافة أربعة microliters من DNase إلى كل أنبوب ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حين تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة.بعد ذلك، إضافة 10 ميكرولترات من RNase المخفف ومزيج جيد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بينما تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة. ثم، الطرد المركزي في 15،000 مرة ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لمسح lysate.جمع بعناية فائقة، وحفظ عينات المدخلات لعينات RWB وRRI. أولاً، أضف ملليلتر واحد من اللسات إلى الخرز المعد، وتدوير العينات عند أربع درجات مئوية إما لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها. بعد هذا، وجمع الخرز مع موقف مغناطيسي، وتجاهل ناظر.غسل الخرز مرتين مع 900 ميكرولترات من العازلة عالية الملح، ومن ثم غسل الخرز مرتين مع 900 ميكروليتر من العازلة الغسيل. ثم، وغسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من 1x عازلة dephosphorylation. أولاً، تخلص من الماظر الفائقة، واستخدم نصائح ماصة دقيقة لإزالة أي سائل متبقي.إضافة 25 ميكروليتر من ثلاثة رئيس المزيج الرئيسي الربط إلى كل عينة، وماصة بعناية لخلط. إضافة 2.5 ميكرولترات من محول RNA X1A و 2.5 ميكرولترات من محول RNA X1B لكل عينة. مزيج بعناية عن طريق الأنابيب أو الخفقان.احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة، مع التأكد من نفض الغبار أنبوب لخلط كل 10 دقيقة. غسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من عازلة غسل الباردة. بعد ذلك ، اغسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت عالي الملح البارد ثم مع 500 ميكرولتر من عازلة الغسيل البارد.كرر كل من هذه يغسل مرة أخرى. المغناطيسي فصل الخرز، واستخدام نصائح دقيقة ماصة لإزالة أي السائل المتبقية. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة غسل الباردة، ونقل 20 ميكرولترات إلى أنابيب جديدة وعينات RWB.إضافة 7.5 ميكرولترات من 4x LDS عينة العازلة وثلاثة ميكرولترات من 10x عينة وكيل الحد من العينات المتبقية. احتضان في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بينما تهتز في 1، 200 دورة في الدقيقة. بعد هذا، تبريد العينات على الجليد لمدة دقيقة واحدة، والطرد المركزي في 1،000 مرات ز وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.لRWB هلام، ووضع أنابيب على المغناطيس، وتيّل البروتين منفصلة من الخرز. تحميل 15 ميكرولترات من عينة في كل بئر. بعد ذلك، إضافة 500 ميكرولترات من مضادات الأكسدة إلى 500 ملليلتر من 1x SDS تشغيل العازلة.تشغيل الجل في 200 فولت، 1x SDS تشغيل العازلة لمدة 50 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ في الجزء السفلي. نقل مجمعات البروتين RNA من هلام إلى غشاء نيتروسيلولوز في 10 فولت لمدة 70 دقيقة في 1x نقل العازلة مع 10٪ الميثانول. منع غشاء RWB في 5٪ الحليب في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.شطف الغشاء في TBST، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية في TBST بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، اغسل مرتين مع TBST، مع كل غسل يدوم خمس دقائق. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم، وغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST. المقبل, مزيج وحدات التخزين متساوية من المخزن A ECL والعازل B.Add هذا الخليط إلى الغشاء, واحتضان لمدة دقيقة واحدة. غطي الغشاء بلفاف بلاستيكي، وتعرّضه لفيلم أشعة سينية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل تطوير الفيلم.في هذه الدراسة ، MOV10 eCLIP في الخصيات من الفئران من النوع البري الكبار مع RNase أنا علاج lysate عبر الارتصال ، يتم إثراء البروتين المستهدف ، الذي هو ما يقرب من 114 كيلودالتون ، بنجاح. نتائج qPCR من cDNA المخفف واحد إلى 10 من عينات مختلفة يكشف أن العينات غير crosslinked تظهر انخفاض استرداد الحمض النووي الريبي. ويلاحظ أن قيم Ct للمجموعة غير ذات الروابط المتقاطعة تزيد عموماً خمس مرات عن مجموعة الأشعة فوق البنفسجية المتداخلة.تظهر النتائج التمثيلية لتضخيم PCR واختيار الحجم عبر agarose هلام الكهرباء هنا. يظهر المنتج التمهيدي-الديمر في حوالي 140 زوجًا أساسيًا. عرض مستعرض الجينوم UCSC من اثنين من تسلسل subclone تمثيلية تبين أن علامات eCLIP منضم MOV10 وجدت أن تكون موجودة داخل UTR ثلاثة رئيس من الجينات Fto.معدل تقريبي من ثلاثة prime UTR الأهداف تمثل 75٪ يتسق مع غالبية الأهداف MOV10 في خلايا HEK293 وفي الخصيات. وعلى النقيض من ذلك، تم العثور على علامات eCLIP منضمة MOV10L1 لتكون موجودة داخل كتلةrna، مما يشير إلى MOV10L1 يستهدف السلائف الرنا. ويمثل المعدل التقريبي لأهداف السلائف الخاصة ببيرنا 42 في المائة مما يعكس اتجاهاً من الدراسات السابقة.MOV10L1 eCLIP مع 40 وحدة لكل ملليلتر RNase أنا هضم يعطي تسلسل أكثر نسبيا مع أزواج قاعدة أقل من 20. ويمثل هذا البروتوكول الموصوف هنا استخدام لأسلوب eCLIP في الاستنساخ، وهو مجال تكون فيه المعرفة بالتفاعل بين RNA و RBP غير كافية إلى حد ما.

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

أداء الغسل المهبلي، كريستال تلوين بنفسجي، والتقييم النسيجية المهبلية لتحديد دورة دقي الماوس التدريج

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في<em&gt; الدروسوفيلاميلانوجاستر</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...