Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Ringraziamo Eric L Van Nostrand e gene W Yeo per una guida utile con il protocollo originale. K.Z. è stato supportato da National Key R & D programma della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31771653). L.Y. è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81471502, 31871503) e dal programma innovativo e imprenditoriale della provincia di Jiangsu.

Tutti gli esperimenti condotti sugli animali sono stati approvati dal comitato universitario di medicina di Nanjing. I topi maschi topi C57BL/6 sono stati mantenuti in condizioni di fotoperiodo controllato e sono stati forniti con cibo e acqua.
1. raccolta dei tessuti e crosslinking UV
<ol><li>Euthanize 2 topi adulti che utilizzano anidride carbonica (CO2) per 1-2 min o fino a quando la respirazione si arresta. Successivamente, eseguire la dislocazione cervicale su ogni mouse.</li...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

Con la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS20,32,33, 34,35. Il protocollo qui descritto rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.
Una sfida ne...

Il testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell'emergere dell'inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l'inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi3. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale, in cui le proteine leganti l'RNA (RBPs) svolgono un ruolo cruciale, modellando il trascrittoma e mantenendo la fertilità maschile.
Per identificare gli obiettivi di RNA in buona fede di un singolo RBP in vivo, è stato sviluppato il metodo reticolazione immunoprecipitazione (clip)4,5, basato ma oltre l'immunoprecipitazione dell'RNA regolare (RIP)6,7 , per incorporazione di passaggi chiave tra cui cross-linking ultravioletti (UV), lavaggio rigoroso e trasferimento di gel per migliorare la specificità del segnale. L'applicazione avanzata della CLIP combinata con il sequenziamento ad alto rendimento ha suscitato grande interesse nella profilazione dell'interazione proteina-RNA a livelli di genoma8. Oltre agli studi genetici sulla funzione RBP, tali metodi biochimici che identificano l'interazione diretta di proteina e RNA endogeni sono stati indispensabili per chiarire accuratamente i ruoli normativi dell'RNA nei RPB. Ad esempio, MOV10L1 è una elicasi di RNA specifica per i testicoli necessaria per la fertilità maschile e la biogenesi9dell'RNA che interagisce con PIWI (Pirna). Il suo paralogo MOV10 è conosciuto come un onnipresente e multifunzionale RNA elicasi con ruoli in molteplici aspetti della biologia dell'RNA10,11,12,13,14 , 15 anni di , 16 anni di , 17 anni di , 18. impiegando le clip-Seq convenzionali, abbiamo scoperto che MOV10L1 lega e regola i precursori Pirna primari per avviare l'elaborazione iniziale di Pirna19,20, e che MOV10 lega le UTR di mRNA 3' e così come RNA non codificante specie nelle cellule germinate testicolari (dati non mostrati).
Tuttavia, CLIP è in origine una laboriosa, procedura radioattiva seguita da sequenza di preparazione della libreria con una notevole perdita di tag CLIP. Nella CLIP convenzionale, una libreria cDNA viene preparata utilizzando adattatori ligati ad entrambe le estremità dell'RNA. Dopo la digestione delle proteine, i polipeptidi corti reticolati restano attaccati ai frammenti di RNA. Questo segno di reticolazione blocca parzialmente la progressione della trascrittasi inversa (RTase) durante la sintesi di cDNA, risultando in cDNA troncati che rappresentano circa il 80% della libreria cDNA21,22. Pertanto, vengono sequenziati solo i frammenti cDNA risultanti da RTase che bypassano il sito di reticolazione (read-through). Recentemente, diversi approcci di CLIP, come PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, sono stati impiegati per identificare i siti Crosslink di RBPs nelle cellule viventi. PAR-CLIP prevede l'applicazione di 365 nm di radiazione UV e analoghi nucleotidici fotoattivabili ed è quindi esclusivo per le cellule viventi in-coltura, e l'incorporazione di analoghi nucleosidici in trascrizioni di nuova sintesi è incline a produrre pregiudizi dove RNA interagisce fisicamente con la proteina23,24. In iCLIP, solo un singolo adattatore è legato all'estremità 3' di frammenti di RNA reticolati. Dopo la trascrizione inversa (RT), i cDNA troncati e read-through sono ottenuti mediante circolarizzazione intramoleularmente e re-linearizzazione seguita dall'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)25,26. Tuttavia, l'efficienza della circolarizzazione intramolecolare è relativamente bassa. Sebbene i vecchi protocolli clip debbano etichettare l'RNA reticolato con un radioisotopo, il reticolazione ultravioletta e la purificazione dell'affinità (uvclap), con un processo di rigorosa purificazione dell'affinità di tandem, non si basano sulla radioattività27. Tuttavia, uvCLAP è limitato alle cellule coltivate che devono essere trasfected con il vettore di espressione portando il 3x FLAG-HBH tag per la purificazione di affinità tandem.
In eCLIP, gli adattatori sono stati legati prima all'estremità 3' dell'RNA seguita da RT, e successivamente all'estremità 3' dei cDNA in modalità intermolecolare. ECLIP è quindi in grado di catturare tutti i cDNA28troncati e read-through. Inoltre, non è limitato all'etichettatura radioattiva, né all'utilizzo di linee cellulari basate sul suo principio, pur mantenendo la risoluzione a singolo nucleotide.
Qui, forniamo una descrizione passo-passo di un protocollo eCLIP adattato per testis del mouse. Brevemente, questo protocollo eCLIP inizia con reticolazione UV dei tubuli testicolari, seguita da digestione parziale della RNAsi e immunoprecipitazioni utilizzando un anticorpo specifico per le proteine. Successivamente, l'RNA legato alla proteina è defosforilato e l'adattatore è legato alla sua estremità 3'. Dopo l'elettroforesi del gel proteico e il trasferimento da gel a membrana, l'RNA è isolato tagliando l'area della membrana di una gamma di dimensioni attese. Dopo RT, l'adattatore DNA è legato all'estremità 3' del cDNA seguita dall'amplificazione della PCR. Lo screening dei subcloni prima del sequenziamento ad alto throughput è considerato un controllo di qualità della libreria. Questo protocollo è efficace nell'identificare le principali specie di RNA legato alle proteine di RBPs, esemplificato dai due RNA che esprimono i testicoli MOV10L1 e MOV10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

La spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l'importanza della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell'RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l'uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3' regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.

La procedura eclip e i risultati sono illustrati nella figura 1, figura 2, Figura 3, figura 4. I topi sono stati eutanizzati con anidride carbonica e una piccola incisione è stata fatta nel basso addome utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2a</st...

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Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

Le proteine leganti l'RNA sono essenziali per la fisiologia cellulare. È importante sottolineare che gli RBP sono altamente espressi in tutta la spermatogenesi e sono stati ben documentati come regolatori post-trascrittivi essenziali durante tutte le fasi delle cellule germinali. L'identificazione di obiettivi vincolanti è fondamentale per chiarire i ruoli meccanicistici di RBP.Questo protocollo rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP per catturare obiettivi endogeni di RNA diretto e stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli dei mammiferi. Il vantaggio principale di questo metodo è che non è radioattivo, richiede meno tempo e fornisce un rapporto segnale-rumore più forte perché l'ingresso abbinato alle dimensioni fungerà da sfondo appropriato per obiettivi autentici. Infine, riteniamo che il sequenziamento su piccola scala dei subclones sia utile per seguire il sequenziamento profondo.A dimostrare la procedura sarà Xu Qiushi, il mio collega. Per iniziare questa procedura, raccogliere circa 100 milligrammi di tester da topi di età appropriata per ogni esperimento di immunoprecipitazione. Posizionare i tessuti in PBS ghiacciato.Utilizzando un paio di pinzette a punta fine, rimuovere delicatamente la tunica albuginea. Aggiungere tre millilitri di PBS ghiacciato a una smerigliatrice di tessuto e utilizzare un pestello di vetro sciolto per triturare il tessuto con una leggera forza meccanica. Successivamente, trasferire la sospensione del tessuto in un piatto di coltura cellulare e aggiungere PBS ghiacciato fino a sei millilitri.Agitare rapidamente il piatto in modo che il liquido copra il fondo del piatto in modo uniforme. Incrociare la sospensione sul ghiaccio tre volte con 400 millijoule per centimetro squadrato a 254 nanometri. Assicurarsi di mescolare la sospensione tra ogni irradiazione.Quindi, raccogliere la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1.200 volte g e a quattro gradi per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS. Successivamente, trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per due minuti, e scartare il supernatante. In primo luogo, aggiungere 125 microlitri di proteine A perline magnetiche per campione a un tubo di centrifuga fresco. Posizionare il tubo sul magnete per separare le perline dalla soluzione.Dopo 10 secondi, rimuovere il supernatante e lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lysis ghiacciato. Rimescolare le perline in 100 microlitri di tampone di lysis fredda con 10 microgrammi di anticorpo eCLIP. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 45 minuti.Quindi, lavare le perline due volte con un millilitro di tampone di lisi ghiacciata. Per iniziare, rimescolare il pellet di tessuto in un millilitro di tampone di lisi fredda contenente 22 microlitri di cocktail inibitore proteico privo di EDTA 50x e 11 microlitri di inibitore della RNasi. Continuare a lysing i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.Sonicare ogni campione come delineato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere quattro microlitri di DNasi a ciascun tubo e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti tremando a 1.200 giri/min.Dopodiché, aggiungere 10 microlitri di RNasi diluita e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti tremando a 1.200 giri/min. Quindi, centrifuga a 15.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti per cancellare il lisato.Raccogliere con cura il supernatante e salvare campioni di input per campioni RWB e RRI. In primo luogo, aggiungere un millilitro del lysate alle perline preparate e ruotare i campioni a quattro gradi Celsius per due ore o durante la notte. Dopo questo, raccogli le perline con un supporto magnetico e scarta il supernatante.Lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone ad alto sale, quindi lavare le perline due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Quindi, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di fosforilazione 1x. In primo luogo, scartare il supernatante e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo.Aggiungere 25 microlitri di mix principale di ligation a tre primi a ciascun campione e pipettare con cura per mescolare. Aggiungere 2,5 microlitri di adattatore RNA X1A e 2,5 microlitri di adattatore RNA X1B a ciascun campione. Mescolare con cura pipettando o sfogliando.Incubare a 25 gradi Celsius per 75 minuti, assicurandosi di scorrere il tubo per mescolare ogni 10 minuti. Lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo. Successivamente, lavare le perline una volta con 500 microlitri di tampone freddo ad alto sale e quindi con 500 microlitri di tampone di lavaggio a freddo.Ripeti entrambi questi lavaggi ancora una volta. Separare magneticamente le perline e utilizzare punte di pipetta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Rimostrare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio a freddo e spostare 20 microlitri in nuovi tubi come campioni di RWB.Aggiungere 7,5 microlitri di tampone campione LDS 4x e tre microlitri di agente riducente del campione 10x ai campioni rimanenti. Incubare a 70 gradi Celsius per 10 minuti mentre si trema a 1.200 giri/min. Dopo questo, raffreddare i campioni sul ghiaccio per un minuto e centrifugare a 1.000 volte g e a quattro gradi Celsius per un minuto.Per il gel RWB, posizionare i tubi su un magnete e separare l'eluito proteico dalle perline. Caricare 15 microlitri di campione in ogni pozzo. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di antiossidante a 500 millilitri di 1x tampone di funzionamento SDS.Eseguire il gel a 200 volt, 1 tampone di funzionamento SDS per 50 minuti o fino a quando la parte anteriore del colorante è nella parte inferiore. Trasferire i complessi proteina-RNA dal gel a una membrana di nitrocellulosa a 10 volt per 70 minuti in tampone di trasferimento 1x con 10%metanolo. Bloccare la membrana RWB nel 5% di latte in TBST a temperatura ambiente per un'ora.Risciacquare la membrana in TBST e incubare con anticorpi primari in TBST durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo questo, lavare due volte con TBST, con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Incubare con anticorpi secondari in TBST a temperatura ambiente per un'ora.Quindi, lavare la membrana tre volte con TBST. Quindi, mescolare volumi uguali di tampone ECL A e tampone B.Aggiungere questa miscela alla membrana e incubare per un minuto. Coprire la membrana con un involucro di plastica ed esporla a una pellicola a raggi X a temperatura ambiente per due o tre minuti prima di sviluppare il film.In questo studio, MOV10 eCLIP nei teste di topi adulti di tipo selvatico con RNasi I che tratta il lisato reticolato, la proteina bersaglio, che è di circa 114 kilodaltoni, viene arricchita con successo. I risultati qPCR del cDNA diluito uno a 10 da vari campioni rivelano che i campioni non collegati a croce mostrano una diminuzione del recupero dell'RNA. Si osserva che i valori Ct del gruppo non reticente sono generalmente cinque volte superiori al gruppo uv-crosslinked.Qui sono riportati i risultati rappresentativi per l'amplificazione della PCR e la selezione delle dimensioni tramite elettroforesi del gel di agarosio. Il prodotto primer-dimer appare a circa 140 coppie di basi. La vista UCSC Genome Browser di due sequenze rappresentative di subclone mostra che i tag eCLIP associati a MOV10 si trovano all'interno dell'UTR a tre numeri primi del gene Fto.Il tasso approssimativo di destinazioni UTR a tre numeri primi rappresenta il 75% è coerente con la maggior parte degli obiettivi MOV10 nelle celle HEK293 e nei teste. Al contrario, i tag eCLIP associati a MOV10L1 si trovano all'interno di un cluster di piRNA, indicando che MOV10L1 prende di mira i precursori di piRNA. Il tasso approssimativo di obiettivi precursori del piRNA rappresenta il 42% che riflette una tendenza degli studi precedenti.MOV10L1 eCLIP con una digestione RNasi I da 40 unità per millilitro produce relativamente più sequenze con meno di 20 coppie di basi. Questo protocollo qui descritto rappresenta un impiego del metodo eCLIP nella riproduzione, un'area in cui la conoscenza dell'interazione RNA-RBP è piuttosto insufficiente.

Research

JoVE Journal

Biology

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