Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

우리는 원래 프로토콜에 도움이 되는 지침에 대 한 에릭 L 밴 Nostrand과 유전자 W 감사 합니다. K.Z.는 중국의 국가 키 R & D 프로그램 (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) 및 중국의 국가 자연 과학 재단 (31771653)에 의해 지원 되었다. L.Y.는 중국의 국립 자연과학 재단 (81471502, 31871503)과 강 소 지방의 혁신적이 고 기업가 프로그램에 의해 지원 되었다.

모든 수행 동물 실험은 난징 의료 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다. 수 컷 C57BL/6 마리의 마우스는 조절 된 광 기간 조건 하에서 유지 되었고, 음식과 물과 함께 공급 되었다.
1. 조직 수확 및 UV 가교 결합
<ol><li>성인 마우스 2 개를 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 이산화탄소를 이용 하 여 안락사 시켰다. 다음, 각 마우스에 자 궁 경부 탈 구를 수행.</li>
	<li>각각...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

생물학적 및 병리학 적 맥락에서 rbps의 보편적 역할에 대 한 이해가 증가 함에 따라, 클립 방법은 rbps20,32,33의 분자 기능을 공개 하는 데 널리 활용 되 고 있습니다. 34,35. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스 고환에 대 한 eCLIP 방법의 적응 된 응용 프로그램을 나타냅니다.
<p...

포유류 고환은 다 수의 정자를 생산 하기 위해 복잡 한 세포 분화 프로그램이 순환적으로 실행 되는 우수한 발달 모델을 나타낸다. 이 모델의 독특한 가치는 정자의 특정 단계에서 전사 불 활성화의 출현에 놓여 있으며, 일반적으로 meiotic 성 염색체 불 활성화 (MSCI)가 발생 하면1,2 및 둥근 spermatogenesis가 발생할 때 세정 동안 급격 한 핵 압축. 이 연속적인 전사 이벤트는 RNA 결합 단백질 (RBPs)이 전사체를 형성 하 고 남성의 비 옥을 유지 하는 중요 한 역할을 하는 전사 후 유전자 조절을 필요로 합니다.
생체 내에서 개별 rbp의 선의의 rna 표적을 규명 하기 위해, 상기 가교 면역 침전 (CLIP) 법은 통상의 rna 면역 침전 (RIP)을 넘어서는것을 기준으로4,5를 개발 하였으며,7 , 자외선 (UV) 가교 결합, 엄격한 세척 및 겔 전달을 포함 하는 주요 단계의 혼 입에 의해 신호 특이성을 향상 시킨다. 고 처리량 시퀀싱과 결합 된 클립의 진보 된 응용은 게놈 전체 수준8에서 단백질 RNA 상호작용을 프로 파일링 하는 것에 큰 관심을 불러 일으킨 것입니다. RBP 기능에 대 한 유전 연구 외에, 내 인 성 단백질과 RNA의 직접적인 상호 작용을 식별 하는 이러한 생화학 적 방법은 Rbp의 RNA 규제 역할을 정확 하 게 해명 하는 데 필수적입니다. 예를 들어, MOV10L1는 남성의 비 옥 및 Piwi 상호작용 RNA (피 르 나) 생물 발생9에 필요한 고환 특이 rna 헬 리 아 제 이다. 그것의 paralogue MOV10는 rna 생물학의 다 양상에서 역할을 가진 ubiquitously 표현 되 고 다기능 rna 헬 리 아 제로 알려져 있습니다10,11,12,13 , 15 , 16 , 17 , 18. 종래의 클립-서 열을 채용 함으로써, 우리는 MOV10L1이 초기 피 르 나 전 구체를 결합 하 고 조절 하는 것을 발견19,20, 그리고 MOV10 mRNA 3 ' utrs 뿐만 아니라 비 코딩 RNA를 개시 하기 위하여 고환 배아 세포의 종 (데이터가 표시 되지 않음).
그럼에도 불구 하 고, 클립은 원래 힘든, 클립 태그의 현저한 손실로 시퀀싱 라이브러리 준비 뒤에 방사성 절차. 종래의 클립에 있어서, cDNA 라이브러리는 양쪽 RNA 말단에서 결 찰 어댑터를 사용 하 여 제조 된다. 단백질 소화 후, 가교 된 짧은 폴 리 펩타이드는 RNA 단편에 부착 된 상태로 유지 됩니다. 이 가교 마크는 cdna 합성 동안 부분적으로 역방향 역전사 (rtase) 진행을 차단 하 여, cdna 라이브러리21,22의 약 80%를 나타내는 잘린 cdnas를 생성 한다. 따라서, 가교 결합 부위 (read)를 우회 하는 RTase에서 기인 하는 cDNA 단편만이 시퀀싱 된다. 최근에는 파 클립, iCLIP, eCLIP 및 uvCLAP와 같은 다양 한 클립 접근법이 살아있는 세포에서 RBPs의 크로스 링크 사이트를 식별 하는 데 사용 되었습니다. PAR 클립은 365 nm UV 방사선 및 광 활성화 가능한 뉴클레오티드 유사 체의 적용을 포함 하 고, 따라서 배양 살아있는 세포에 배타적 이며, 새로 합성 된 전사체에 뉴 클레 오 유사 체의 혼 입은 편견을 일으키기 쉽다 RNA가 물리적으로 단백질23,24와 상호 작용 하는 곳. ICLIP에서 단일 어댑터만이 가교 된 RNA 단편의 3 ' 말단에 결 찰 됩니다. 역 전사 (RT) 후에, 잘린 및 읽기-스루 cdnas는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭25,26에의 한 인트라 내 순환 화 및 재 선형화에 의해 얻어진 다. 그러나, 분 자체 순환의 효율은 상대적으로 낮다. 구형 클립 프로토콜은 방사성 동위 원소, 자외선 가교 결합 및 친화성 정제 (uvCLAP)와 함께 가교 된 RNA의 라벨링이 필요 하지만, 엄격한 탠덤 친화성 정제 과정을 통해 방사능27에 의존 하지 않는다. 그럼에도 불구 하 고, uvCLAP는 탠덤 친화성 정제를 위해 3x FLAG-HBH 태그를 운반 하는 발현 벡터로 형질 감염 되어야 하는 배양 세포로 제한 된다.
ECLIP에서, 어댑터는 RT의 3 인치 말단에서 먼저, 그리고 분자 간 모드에서 cDNAs의 3 가지 말단에서 다음으로 결 찰 되었습니다. 따라서, eCLIP은 모든 절단 및 판독을 통해 cDNA (28)를 캡처할 수 있다. 또한, 단일 뉴클레오티드 분해능을 유지 하면서도, 방사성 라벨링에 국한 되지 않고, 그 원리에 기초한 세포 주를 사용 하지 않는다.
여기서는 마우스 고환에 적합 한 eCLIP 프로토콜에 대 한 단계별 설명을 제공 합니다. 간단히 말해서,이 eCLIP 프로토콜은 고환 세관의 UV 가교 결합으로 시작 하 여 단백질 특이 적 항 체를 사용 하는 부분적인 RNase 소화 및 면역 침전이 이어집니다. 다음으로, 단백질 결합 RNA는 dephosphorylated이 고, 어댑터는 3 ' 말단으로 결 찰 된다. 단백질 겔 전기 영동 및 겔-막 전달 후, RNA는 예상 된 크기 범위의 멤브레인 영역을 절단 하 여 분리 된다. RT 후, DNA 어댑터는 PCR 증폭에 이어서 cDNA의 3 ' 말단에 결 찰 된다. 높은 처리량 시퀀싱 전에 서브 클론의 스크리닝은 라이브러리 품질 관리로 취합니다. 이 프로토콜은 두 개의 고환 발현 RNA 헬 리 아 제 MOV10L1 및 MOV10에 의해 예시 되는 RBPs의 단백질 결합 RNA의 주요 종을 식별 하는 데 효율적입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

정자 생성은 포유류에서 남성 생식 세포 분화의 고도로 주문 된 과정을 정의 합니다. 고환에서, 전사 및 번역은 결합 되지 않습니다, RBPs에 의해 조율 된 유전자 발현의 포스트 전사 조절의 중요성을 밑줄. RBP의 기계적 역할을 명료 하 게 하기 위해, 가교 면역 침전 (CLIP) 방법론은 내 인 성 직접 RNA 표적을 포착 하 고 실제 상호작용 부위를 정의 하는데 사용 될 수 있다. 향상 된 클립 (eCLIP)은 기존 클립에 비해 여러 가지 장점을 제공 하는 새롭게 개발 된 방법입니다. 그러나, eCLIP의 사용은 지금까지 확장 된 응용 프로그램에 대 한 호출, 셀 라인에 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 고환에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아 제를 연구 하기 위해 eCLIP을 사용 했습니다. MOV10 및 MOV10L1 예상한 바와 같이, 우리는 MOV10 우세 하 게 mRNA의 3 ' 미 번역 지역 (UTRs)에 결합 하 고 MOV10L1 선택적으로 Piwi 상호 작용 RNA (피 르 나) 전 구체 전사체에 묶는 것을 발견 합니다. 우리의 eCLIP 방법은 깊은 시퀀싱을 진행 하기 위한 영장으로 서브 클론의 소규모 시퀀싱 및 자격을 갖춘 라이브러리의 가용성을 통해 다양 한 RBPs에 의해 바인딩된 주요 RNA 종의 빠른 결정을 할 수 있습니다. 본 연구는 포유류 고환에서의 eCLIP에 대 한 적용 가능한 기초를 확립 한다.

상기 eclip 절차 및 결과는도 1,도 2,도 3에 도시 되어 있다. 마우스는 외과 용가 위를 이용 하 여 하복 부에 제조 하였으며 작은 절 개를 이산화탄소로 안락사 시켰다 (도 2a,B</strong...

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Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA 결합 단백질은 세포 생리학에 필수적입니다. 중요한 것은, RBP는 정자 발생을 통해 높게 표현되고 세균 세포의 모든 단계 도중 필수적인 전사 후 레귤레이터로 잘 문서화되었습니다. 바인딩 대상의 식별은 RBP의 기계주의 적 역할을 해명하는 데 중요합니다.이 프로토콜은 내인성 직접 RNA 표적을 포착하고 포유류 고환에서 eCLIP에 대한 적용 가능한 기초를 확립하기 위한 eCLIP 방법의 적응된 적용을 나타낸다. 이 방법의 주요 장점은 비방사성, 적은 시간 집약적이며, 크기 일치 입력이 본격적인 대상에 적합한 배경역할을 하기 때문에 더 강한 신호 대 잡음 비율을 제공한다는 것입니다. 마지막으로, 우리는 서브클론의 소규모 시퀀싱이 깊은 시퀀싱을 따르는 데 유용하다고 생각합니다.절차를 시연하는 것은 내 동료 인 쉬 치우시 (Xu Qiushi)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 각 면역 강수량 실험에 적합한 연령의 쥐로부터 약 100 밀리그램의 고환을 수확하십시오. 얼음 차가운 PBS에 조직을 배치합니다.미세 한 기울어진 핀셋을 사용하여 튜니카 알부진을 부드럽게 제거합니다. 3 밀리리터의 얼음-차가운 PBS를 조직 분쇄기에 추가하고 느슨한 유리 유봉을 사용하여 가벼운 기계적 힘으로 조직을 세트리알트합니다. 다음으로, 조직 현탁액을 세포 배양 접시에 옮기고, 최대 6밀리리터까지 얼음차가운 PBS를 추가한다.접시를 빠르게 흔들어 액체가 접시 바닥을 고르게 덮습니다. 254 나노미터에서 제곱 된 센티미터 당 400 밀리 줄로 얼음에 서스펜션을 세 번 크로스 링크. 각 조사 사이에 서스펜션을 혼합해야 합니다.이어서, 15밀리리터 원모형 튜브에서 서스펜션을 수집하고, 원심분리기는 1, 200배, 5분간 4도에서 수집한다. 상체를 제거하고 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 그 후 서스펜션을 1.5밀리리터 원심분리튜브로 옮기는다.원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 폐기하고, 상주분리기를 폐기한다. 첫째, 125 마이크로리터의 단백질 A 마그네틱 비드를 시료당 신선한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 구슬을 용액에서 분리하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다.10초 후, 상체를 제거하고 얼음 차가운 용해 버퍼 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시다. 10 마이크로그램의 eCLIP 항체를 가진 차가운 리시스 완충제의 100 마이크로리터에서 구슬을 재차질한다. 실내 온도에서 45분 동안 튜브를 회전시합니다.그런 다음 얼음 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터로 구슬을 두 번 씻으신다. 시작하려면, 50x EDTA 가없는 단백질 억제제 칵테일의 22 마이크로 리터와 RNase 억제제의 11 마이크로 리터를 포함하는 차가운 용해 완충제의 1 밀리리터에 조직 펠릿을 다시 중단합니다. 15 분 동안 얼음에 샘플을 lysing 유지합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플을 초음파 처리합니다. 다음으로 각 튜브에 4개의 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.그 후, 희석 된 RNase의 10 마이크로 리터를 추가하고 잘 혼합. 섭씨 37도에서 5분간 배양하면서 1, 200 rpm에서 흔들리면 됩니다. 그런 다음 15, 000 배 g및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 제거하여 lysate를 지웁습니다.상체를 신중하게 수집하고 RWB 및 RRI 샘플에 대한 입력 샘플을 저장합니다. 먼저, 준비된 구슬에 용액 1밀리리터를 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 2시간 또는 하룻밤 동안 회전시합니다. 그 후, 자기 스탠드와 구슬을 수집하고, 상체를 폐기.900 마이크로리터의 고염 완충제로 구슬을 두 번 씻은 다음 900 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 두 번 씻습니다. 그런 다음 1x 탈포릴화 버퍼의 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 먼저, 상체를 버리고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거하십시오.각 샘플에 3프라임 리기션 마스터 믹스 25마이크로리터를 추가하고 조심스럽게 파이펫을 섞어 주세요. RNA 어댑터 X1A2.5 마이크로리터와 RNA 어댑터 X1B 2.5 마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 파이펫팅이나 플리킹으로 조심스럽게 섞으세요.75분 동안 섭씨 25도에서 배양하여 튜브를 10분간격으로 섞어보도록 합니다. 차가운 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 다음으로, 차가운 고염 버퍼 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻은 다음 500 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 세척합니다.이 두 가지 세체를 다시 한 번 반복합니다. 구슬을 자기로 분리하고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거합니다. 100 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 구슬을 재차 질주하고 20마이크로리터를 RWB 샘플로 새로운 튜브로 이동합니다.4x LDS 샘플 버퍼 7.5 마이크로리터와 10배 샘플 감소제 3개에 추가하여 나머지 시료에 추가합니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 70도에서 배양하십시오. 그 후, 1 분 동안 얼음에 샘플을 냉각하고 원심 분리기는 1, 000 배 g와 1 분 동안 섭씨 4도에서 냉각합니다.RWB 젤의 경우, 자석에 튜브를 놓고 비드에서 단백질을 분리합니다. 15 마이크로리터의 샘플을 각 우물에 적재합니다. 다음으로, 1x SDS 실행 버퍼의 500 밀리리터에 항산화제 500 마이크로리터를 추가합니다.젤을 200볼트, 1x SDS 러닝 버퍼로 50분 간 또는 염료 전면이 바닥에 다질 때까지 실행합니다. 10%의 메탄올을 사용하여 1x 전달 버퍼에서 70분 동안 10볼트에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질-RNA 복합체를 전달한다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 5 %의 우유로 RWB 멤브레인을 차단하십시오.TBST에서 막을 헹구고, TBST에서 1 차적인 항체로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 그 후 TBST로 두 번 씻고, 각 세척은 5분간 지속됩니다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 이차 항체와 함께 배양하십시오.그런 다음 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으시면 됩니다. 다음으로, ECL 버퍼 A의 동일한 볼륨을 혼합하고 버퍼 B.멤브레인에이 혼합물을 추가하고 1 분 동안 배양합니다. 멤브레인을 플라스틱 랩으로 덮고 필름을 개발하기 전에 실온에서 2 ~3 분 동안 X 선 필름에 노출하십시오.이 연구에서는, RNase를 가진 성인 야생형 마우스의 고환에서 MOV10 eCLIP는 교차형 용재를 치료하고, 표적 단백질은 약 114킬로달톤인 성공적으로 농축된다. 다양한 샘플에서 1-10까지 희석된 cDNA의 qPCR 결과는 비교차식 샘플이 RNA 회수감소를 나타낸다는 것을 보여준다. 비교차 형 그룹의 Ct 값은 일반적으로 UV 크로스 링크 그룹보다 5 배 더 많은 것으로 관찰된다.아가로즈 겔 전기포진을 통한 PCR 증폭 및 크기 선택에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 프라이머 이머 제품은 약 140개의 기본 쌍에 나타납니다. 두 개의 대표적인 서브클론 서열의 UCSC 게놈 브라우저 보기는 MOV10 바운드 eCLIP 태그가 유전자 Fto의 3-PRIME UTR 내에 있는 것으로 밝혀졌다는 것을 보여줍니다.3프라임 UTR 표적의 대략적인 비율은 75%를 차지하며 HEK293 세포 및 고환에서 의 MOV10 표적의 대부분과 일치합니다. 대조적으로, MOV10L1 바운드 eCLIP 태그는 piRNA 클러스터 내에 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MOV10L1이 piRNA 전구체를 대상으로 한다는 것을 나타낸다. piRNA 전구체 표적의 대략적인 비율은 이전 연구 결과에서 추세를 반영하는 42%를 차지합니다.MOV10L1 eCLIP은 밀리리터당 40단위 RNase I 소화로 20개 미만의 베이스 쌍으로 비교적 더 많은 시퀀스를 생성합니다. 여기서 설명된 이 프로토콜은 RNA-RBP 상호작용 지식이 다소 부족한 재생에 eCLIP 방법의 고용을 나타낸다.

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

연구

생물학

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된<em&gt; 초파리 Melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...