Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Vi takker Eric L Van Nostrand og Gene W Yeo for nyttig veiledning med den opprinnelige protokollen. K.Z. var understøttet av nasjonal nøkkel R & D program av porselen (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), og nasjonal naturlig vitenskap opprettelsen av porselen (31771653). Ly ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) og innovativ og gründer program av Jiangsu Province.

Alle utførte dyre eksperimenter er godkjent av Nanjing Medical University Committee. Mann C57BL/6 mus ble holdt under kontrollerte photoperiod forhold og ble levert med mat og vann.
1. vev høsting og UV Cross Linking
<ol><li>Euthanize 2 voksen mus bruker karbondioksid (CO2) for 1-2 min eller til pusten stopper. Deretter utfører du cervical forvridning på hver mus.</li>
	<li>Harvest ca 100 mg testiklene fra mus av passende alder (en voksen testikkel i denne studien) for hver im...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

Med økende forståelse av den universelle rolle RBPs under både biologiske og patologiske kontekster, har klipp metodene blitt mye benyttet for å avdekke molekyl funksjonen til RBPs20,32,33, 34,35. Protokollen som beskrives her, representerer en tilpasset anvendelse av eCLIP-metoden til mus-testikkel.
En utfordring i å utføre ...

Pattedyr testikkel representerer en utmerket utviklingsmessige modell hvor en intrikat celle differensiering programmet går syklisk å gi mange spermatozoa. En unik verdi av denne modellen ligger i fremveksten av transcriptional inaktive på visse stadier av spermatogenesis, vanligvis når meiotic sex kromosom inaktive (MSCI) oppstår1,2 og når runde via gjennomgår drastisk kjernefysisk komprimering under spermiogenesis3. Disse sammenhengende transcriptional hendelsene nødvendiggjør transcriptional gen regulering, der RNA-bindende proteiner (RBPs) spiller en avgjørende rolle, former transcriptome og opprettholder mannlig fertilitet.
Å identifisere bona fide RNA målene for en individuell RBP in vivo, den Cross Linking immunutfelling (klipp) metoden ble utviklet4,5, basert på, men utover den vanlige RNA immunutfelling (RIP)6,7 , ved inkorporering av viktige trinn inkludert ultrafiolett (UV) Cross Linking, strenge vask og gel overføring for å forbedre signal spesifisitet. Den avanserte anvendelsen av CLIP kombinert med høy gjennomstrømming sekvensering har provosert stor interesse for profilering protein-RNA interaksjon på Genova-brede nivåer8. I tillegg til genetiske studier på RBP funksjon, har slike biokjemiske metoder som identifiserer det direkte samspillet av endogene proteiner og RNA vært uunnværlig for å nøyaktig belyse de RNA regulatoriske rollene til RBPs. For eksempel, MOV10L1 er en testikkel-spesifikk RNA-helicase som er nødvendig for mannlig fertilitet og Piwi RNA (piRNA) kognitiv9. Dens paralogue MOV10 er kjent som en overalt uttrykt og multifunksjonell RNA helicase med roller i flere aspekter av RNA biologi10,11,12,13,14 , 15 priser og , 16 flere , 17 i , 18. ved å ansette den konvensjonelle Clip-SEQ, fant vi at MOV10L1 binder og regulerer primære piRNA forløpere til å initiere tidlig piRNA prosessering19,20, og at MOV10 binder mRNA 3 ' UTRs og så vel som Noncoding RNA arter i testicular bakterieceller (data ikke vist).
Imidlertid er CLIP opprinnelig en møysommelig, radioaktivt prosedyre etterfulgt av sekvensering biblioteket forberedelse med et bemerkelsesverdig tap av CLIP-koder. I den konvensjonelle CLIP, en cDNA biblioteket er utarbeidet ved hjelp av adaptere ligaturer på begge RNA ekstremiteter. Etter at protein fordøyelsen, krysskoblet korte polypeptider fortsatt festet til RNA fragmenter. Dette Cross Linking merket delvis blokkerer Reverse transkriptase (RTase) progresjon under cDNA syntese, noe som resulterer i avkortet cDNAs som representerer ca 80% av cDNA biblioteket21,22. Således, bare cDNA fragmenter resulterer fra RTase omgåelsen det Cross Linking sted (lese-igjennom) er sekvensert. I den seneste tid, forskjellige hefte tilnærmelser, som PAR-hefte, iCLIP, eCLIP og uvCLAP, ha blitt ansatt å identifisere krysskobling steder av RBPs inne leverceller. PAR-CLIP innebærer anvendelse av 365 NM UV-stråling og photoactivatable nukleotid analogs og er derfor eksklusivt til in-dyrking levende celler, og innlemmelse av nukleosid analogs i nylig syntetisert transkripsjoner er tilbøyelig til å produsere bias der RNA fysisk samhandler med protein23,24. I iCLIP er det kun en enkelt adapter som er ligaturer til 3 ' enden av krysskoblet RNA-fragmenter. Etter omvendt transkripsjon (RT), både avkortet og lese gjennom cDNAs oppnås ved intramolecularly circularization og re-linearization etterfulgt av polymerase kjedere reaksjon (PCR) forsterkning25,26. Imidlertid er effektiviteten av intramolekylær circularization relativt lav. Selv om eldre CLIP protokoller trenger merking av krysskoblet RNA med en radioisotop, ultrafiolett Cross Linking og affinitet rensing (uvCLAP), med en prosess av strenge tandem affinitet rensing, ikke stole på radioaktivitet27. Likevel, uvCLAP er begrenset til kulturperler celler som må transfekterte med uttrykket vektor bærer 3x FLAG-HBH tag for tandem affinitet rensing.
I eCLIP ble adaptere ligaturer først på 3 ' enden av RNA etterfulgt av RT, og ved siden av 3 ' enden av cDNAs i en Intermoleylære modus. Herav, eCLIP er kjøpedyktig fange alle avkortet og lese-igjennom cDNA28. Det er heller ikke begrenset til radioaktivt merking, eller å bruke cellelinjer basert på prinsippet sitt, og samtidig opprettholde nukleotid oppløsning.
Her gir vi en trinnvis beskrivelse av en eCLIP-protokoll som er tilpasset muse testikkel. Kort sagt starter denne eCLIP-protokollen med UV-Cross Linking av testikkel tubuli, etterfulgt av delvis RNase-fordøyelse og immunutfelling ved hjelp av et protein spesifikt antistoff. Deretter blir den protein bundne RNA-en dephosphorylated, og adapteren er ligaturer til dens 3-end. Etter protein gel elektroforese og gel-til-membran-overføring, er RNA isolert ved å skjære membran området til et forventet størrelsesområde. Etter RT er DNA-adapteren ligaturer til 3 ' enden av cDNA etterfulgt av PCR forsterkning. Screening av subclones før høy gjennomstrømming sekvensering er tatt som et bibliotek kvalitetskontroll. Denne protokollen er effektiv til å identifisere store arter av protein-bundet RNA av RBPs, som er et eksempel på de to testikkel RNA helicases MOV10L1 og MOV10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

Spermatogenesis definerer en høyt bestilt prosess av mannlig bakterie celle differensiering i pattedyr. I testikkel, transkripsjon og oversettelse er lokomotivet, understreker viktigheten av post-transcriptional regulering av genuttrykk orkestrert av RBPs. For å belyse mekanistisk roller i en RBP, kan Cross Linking immunutfelling (CLIP) brukes til å fange opp sine endogene direkte RNA-mål og definere de faktiske samhandlings stedene. Den forbedrede CLIP (eCLIP) er en nyutviklet metode som gir flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle klipp. Imidlertid har bruken av eCLIP hittil vært begrenset til cellelinjer, og oppfordret til utvidede applikasjoner. Her har vi ansatt eCLIP for å studere MOV10 og MOV10L1, to kjente RNA-bindende helicases, i mus testikkel. Som forventet, finner vi at MOV10 hovedsakelig binder seg til 3 ' uoversatt regioner (UTRs) av mRNA og MOV10L1 selektivt binder seg til Piwi-samspill RNA (piRNA) forløper transkripsjoner. Vår eCLIP metoden tillater rask bestemmelse av store RNA arter bundet av ulike RBPs via småskala sekvensering av subclones og dermed tilgjengeligheten av kvalifiserte biblioteker, som garanterer for fortsetter med dype sekvensering. Denne studien etablerer et aktuelt grunnlag for eCLIP i pattedyr testikkel.

ECLIP prosedyren og resultatene er illustrert i figur 1, figur 2, Figur 3, Figur 4. Mus ble euthanized med karbondioksid og et lite snitt ble gjort i nedre del av magen ved hjelp av kirurgisk saks (figur 2a,B). Mus testiklen...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Forbedret Cross Linking Immunutfelling (eCLIP) metode for effektiv identifisering av protein-bundet RNA i mus testikkel

Her presenterer vi en eCLIP-protokoll for å fastslå store RNA-mål for RBP-kandidater i testikkel.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA-bindende proteiner er avgjørende for cellulær fysiologi. Viktigere, RBP er høyt uttrykt gjennom spermatogenese og har blitt godt dokumentert som essensielle post-transkripsjonelle regulatorer i alle stadier av bakterieceller. Identifisering av bindende mål er avgjørende for å belyse de mekanistiske rollene til RBP.Denne protokollen representerer en tilpasset anvendelse av eCLIP-metoden for å fange endogene direkte RNA-mål og etablerer et gjeldende grunnlag for eCLIP i pattedyrtestis. Den største fordelen med denne metoden er at den er ikke-radioaktiv, mindre tidkrevende, og gir et sterkere signal-til-støy-forhold fordi den størrelsestilpassede inngangen vil tjene som en passende bakgrunn for autentiske mål. Til slutt tror vi at småsekvensering av underklut er nyttig for å følge dyp sekvensering.Å demonstrere prosedyren vil være Xu Qiushi, min kollega. For å begynne denne prosedyren, høst ca 100 milligram testiklene fra mus av passende alder for hvert immunprecipitation eksperiment. Plasser vevet i iskald PBS.Bruk et par fintippede pinsett, fjern forsiktig tunikaalbugineaen. Tilsett tre milliliter iskald PBS til en vevskvern, og bruk en løs glass pestle for å triturate vevet ved mild mekanisk kraft. Deretter overfører du vevssuspensjonen til en cellekulturrett, og legger til iskald PBS opptil seks milliliter.Rist platen raskt slik at væske dekker bunnen av fatet jevnt. Kryssbind suspensjonen på is tre ganger med 400 millijouler per centimeter kvadrert på 254 nanometer. Pass på å blande suspensjonen mellom hver bestråling.Deretter samler suspensjonen i et konisk rør på 15 milliliter, og sentrifuge ved 1, 200 ganger g og ved fire grader i fem minutter. Fjern den overnaturlige, og resuspend pellet i en milliliter PBS. Etter dette, overføre suspensjon til en 1,5-milliliter sentrifuge rør.Sentrifuge ved 1000 ganger g og ved fire grader Celsius i to minutter, og kast overnatanten. Først legger du til 125 mikroliter protein A magnetiske perler per prøve til et friskt sentrifugerør. Plasser røret på magneten for å skille perlene fra løsningen.Etter 10 sekunder, fjern supernatant, og vask perlene to ganger med en milliliter iskald lysisbuffer. Resuspend perlene i 100 mikroliter kald lysis buffer med 10 mikrogram eCLIP antistoff. Roter rørene ved romtemperatur i 45 minutter.Vask deretter perlene to ganger med en milliliter iskald lysisbuffer. Til å begynne med, resuspend vev pellets i en milliliter kald lysis buffer som inneholder 22 mikroliter av 50x EDTA-fri proteinhemmer cocktail og 11 mikroliter RNase hemmer. Fortsett å lyse prøvene på is i 15 minutter.Sonicate hvert eksempel som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter legger du til fire mikroliter dnase til hvert rør og blander godt. Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter mens risting på 1, 200 rpm.Etter dette legger du til 10 mikroliter fortynnet RNase og bland godt. Inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter mens risting på 1, 200 rpm. Deretter sentrifuge på 15, 000 ganger g og ved fire grader Celsius i 20 minutter for å fjerne lysate.Samle forsiktig opp supernatant, og lagre inndataprøver for RWB- og RRI-prøver. Først legger du til en milliliter av lysatet til de tilberedte perlene, og roterer prøvene ved fire grader Celsius i enten to timer eller over natten. Etter dette samler du perlene med et magnetisk stativ, og kast det overnaturlige.Vask perlene to ganger med 900 mikroliter med høysaltbuffer, og vask deretter perlene to ganger med 900 mikroliter vaskebuffer. Vask deretter perlene en gang med 500 mikroliter av 1x defosforyleringsbuffer. Kast først overnatanten, og bruk fine pipettespisser for å fjerne eventuell restvæske.Tilsett 25 mikroliter med tre-prime ligation master mix til hver prøve, og nøye pipette å blande. Legg til 2,5 mikroliter RNA-adapter X1A og 2,5 mikroliter RNA-adapter X1B i hver prøve. Bland forsiktig ved å pipettere eller flimre.Inkuber ved 25 grader Celsius i 75 minutter, og sørg for å knipse røret for å blande hvert 10. Vask perlene en gang med 500 mikroliter kaldvaskbuffer. Deretter vasker du perlene en gang med 500 mikroliter kald høysaltbuffer og deretter med 500 mikroliter kaldvaskbuffer.Gjenta begge disse vaskene igjen. Magnetisk skille perlene, og bruk fine pipettespisser for å fjerne eventuell gjenværende væske. Resuspend perlene i 100 mikroliter kaldvaskbuffer, og flytt 20 mikroliter til nye rør som RWB-prøver.Legg til 7,5 mikroliter med 4x LDS-prøvebuffer og tre mikroliter på 10x prøvereduserende middel til de gjenværende prøvene. Inkuber ved 70 grader Celsius i 10 minutter mens risting på 1, 200 rpm. Etter dette, avkjøl prøvene på is i ett minutt, og sentrifuge på 1000 ganger g og på fire grader Celsius i ett minutt.For RWB gel, plasser rør på en magnet, og separer protein eluate fra perlene. Legg 15 mikroliter prøve i hver brønn. Deretter legger du til 500 mikroliter antioksidant til 500 milliliter 1x SDS løpebuffer.Kjør gelen på 200 volt, 1x SDS løpebuffer i 50 minutter eller til fargestofffronten er nederst. Overfør protein-RNA-kompleksene fra gelen til en nitrocellulosemembran ved 10 volt i 70 minutter i 1x overføringsbuffer med 10% metanol. Blokker RWB-membranen i 5 % melk i TBST ved romtemperatur i én time.Skyll membranen i TBST, og inkuber med primært antistoff i TBST over natten ved fire grader Celsius. Etter dette, vask to ganger med TBST, med hver vask som varer i fem minutter. Inkuber med sekundært antistoff i TBST ved romtemperatur i en time.Vask deretter membranen tre ganger med TBST. Bland deretter like volumer av ECL-buffer A og buffer B.Legg denne blandingen til membranen, og inkuber i ett minutt. Dekk membranen med plastfolie, og utsett den for en røntgenfilm ved romtemperatur i to til tre minutter før filmen utvikles.I denne studien er MOV10 eCLIP i testiklene fra voksne villtypemus med RNase I som behandler krysskoblet lysat, målproteinet, som er ca. 114 kilodaltonn, vellykket beriket. QPCR-resultatene av cDNA fortynnet en til 10 fra ulike prøver viser at ikke-krysskoblede prøver viser redusert RNA-gjenoppretting. Det observeres at Ct-verdiene til gruppen som ikke er krysskoblet, vanligvis er fem ganger mer enn den UV-krysskoblede gruppen.Representative resultater for PCR-forsterkning og størrelsesvalg via agarose gelelektroforese er vist her. Primer-dimer produktet vises på ca 140 base par. UCSC Genome Browser-visningen av to representative subklonesekvenser viser at MOV10-bundne eCLIP-koder er funnet å være plassert innenfor den tre-prime UTR av genet Fto.Den omtrentlige frekvensen av tre-prime UTR mål står for 75%er i samsvar med de fleste MOV10 mål i HEK293 celler og i testiklene. I motsetning, MOV10L1-bundet eCLIP koder er funnet å være plassert i en piRNA-klynge, indikerer MOV10L1 mål piRNA forløpere. Den omtrentlige frekvensen av piRNA-forløpermål står for 42 %, noe som gjenspeiler en trend fra tidligere studier.MOV10L1 eCLIP med en 40-enhet per milliliter RNase I fordøyelse gir relativt flere sekvenser med mindre enn 20 basispar. Denne protokollen som er beskrevet her representerer en ansettelse av eCLIP-metoden i reproduksjon, et område der RNA-RBP interaksjonskunnskapen er ganske utilstrekkelig.

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Effektiv Differensiering av mus embryonale stamceller i motoriske nevroner

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Utføre Vaginal lavage, Crystal Violet Staining, og vaginal cytologisk Taksering Mouse brunst Staging Identifikasjon

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Chromatin immunoprecipitation hjelp Begrense mengder biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifisering av protein interaksjon Partnere i pattedyrceller Bruke SILAC-immunoprecipitation Kvantitative Proteomikk

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

I Vivo Mikroinjeksjon og Electroporation mus Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Forbedret Northern Blot Påvisning av små RNA Arter i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Meget Effektiv Ligering av små RNA molekyler for mikroRNA kvantifisering av høy gjennomstrømming Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...