Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Vi tackar Eric L van Nostrand och Gene W Yeo för användbar vägledning med det ursprungliga protokollet. K.Z. stöddes av den nationella nyckeln R & D-programmet i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) och Kinas nationella Naturvetenskaps stiftelse (31771653). L.Y. stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) och innovativa och entreprenörs program i Jiangsu-provinsen.

Alla utförda djur försök har godkänts av Nanjing Medical University kommitté. Manliga C57BL/6 möss hölls under kontrollerade foto period förhållanden och levererades med mat och vatten.
1. vävnads skörd och UV-crosslinking
<ol><li>Euthanize 2 vuxna möss som använder koldioxid (CO2) för 1-2 min eller tills andningen avbryts. Därefter utför cervikal störningen på varje mus.</li>
	<li>Skörd ca 100 mg av testiklarna från möss i lämplig ålder (en vuxen vittnar i ...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

Med ökad förståelse för den universella roll RBPs under både biologiska och patologiska sammanhang, har klippet metoder använts i stor utsträckning för att avslöja den molekyl ära funktionen av RBPs20,32,33, 34,35. Protokollet som beskrivs här representerar en anpassad tillämpning av eCLIP metod för att musen testis.
E...

Däggdjurs testiklarna representerar en utmärkt utvecklings modell där en intrikata cell differentiering program löper cykliskt att ge många spermatozoa. Ett unikt värde av denna modell ligger i uppkomsten av transkriptionell inaktive ring vid vissa stadier av spermatogenes, typiskt när meiotiska kön kromosom inaktive ring (MSCI) inträffar1,2 och när runda spermatider genomgå drastiska nukleär packning under spermiogenesis3. Dessa inpå varandra följande transkriptionella händelser nödvändiggör post-transkriptionell gen reglering, där RNA-bindande proteiner (RBPs) spelar en avgörande roll, forma transkriptome och bibehålla manlig fertilitet.
För att identifiera de bona fide RNA-målen för en individuell RBP in vivo, den crosslinking immunutfällning (Clip)-metoden utvecklades4,5, baserat på men bortom den vanliga RNA immunonederbörden (RIP)6,7 , genom införlivande av viktiga steg inklusive ultraviolett (UV) crosslinking, stränga tvätta och gel överföring för att förbättra signalspecificitet. Den avancerade tillämpningen av CLIP kombinerat med hög genom strömning sekvensering har provocerat stort intresse för profilering av protein-RNA interaktion på genomtäckande nivåer8. Förutom genetiska studier av RBP-funktion har sådana biokemiska metoder som identifierar det direkta samspelet mellan endogent protein och RNA varit oumbärliga för att exakt belysa RNA-regulatoriska roller i RBPs. Till exempel, MOV10L1 är en testis-specifika RNA helicase krävs för manlig fertilitet och piwi-interagerande RNA (Pirna) biogenes9. Dess paralogue MOV10 är känd som en ubiquitously uttryckt och multifunktionella RNA helicase med roller i flera aspekter av RNA biologi10,11,12,13,14 , 15 , 16 för att , 17 i den , 18. genom att använda den konventionella Clip-SEQ fann vi att MOV10L1 binder och reglerar primära Pirna prekursorer för att initiera tidig Pirna bearbetning19,20, och att MOV10 binder mRNA 3 ' utrs och liksom icke-kodning RNA arter i testikelköns celler (data visas inte).
Ändå är CLIP ursprungligen ett mödosamt, radioaktivt förfarande följt av sekvensering bibliotek förberedelse med en anmärknings värd förlust av CLIP Taggar. I den konventionella Clip, ett cDNA-bibliotek förbereds med adaptrar liga turer på båda RNA extremiteter. Efter protein nedbrytning förblir tvär bundna korta polypeptider knutna till RNA-fragment. Detta crosslinking mark delvis blockerar omvänd transkriptase (rtase) progression under cDNA syntes, vilket resulterar i trunkerade cdnas som representerar cirka 80% av cDNA-biblioteket21,22. Sålunda, bara cDNA fragment resulterande från RTase förbifartsleden den crosslinking tomt (läsa-igenom) är sekvenserade. På senare tid har olika CLIP-metoder, som PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP och uvCLAP, använts för att identifiera tvär bindnings platser för RBPs i levande celler. PAR-CLIP innebär tillämpning av 365 nm UV-strålning och photoactivatable nukleotid analoger och är därför exklusivt för in-odling av levande celler, och inkorporering av nukleosidanaloger till nyligen syntetiserade utskrifter är benägna att producera bias där RNA fysiskt interagerar med protein23,24. I iclip, endast en enda adapter är liga turer till 3 ' extremiteterna av tvär bunden RNA fragment. Efter Omvänd transkription (RT), både trunkerad och genomläsning cdnas erhålls genom intramoleculärt cirkularization och re-linearization följt av polymeras kedje reaktion (PCR) amplifiering25,26. Emellertid, effektiviteten i Intramolekylär cirkularisering är relativt låg. Även äldre CLIP-protokoll behöver märkning av tvär bunden RNA med en radio isotop, ultraviolett tvär bindning och affinitet rening (uvCLAP), med en process av stränga tandem affinitet rening, inte förlita sig på radio aktivitet27. Icke desto mindre, uvclap är begränsad till odlade celler som måste transfekterade med uttrycket vektor bär 3x Flag-HBH tagg för tandem affinitet rening.
I eclip, var adaptrar liga turer först vid 3 ' extremiteterna av RNA följt av RT, och nästa vid 3 ' extremiteten av cdnas i ett intermolekylärt läge. Sålunda, eCLIP är köpa duktig ta till fånga all stympat och läsa-igenom cDNA28. Dessutom är det varken begränsat till radioaktivt märkning, eller att använda cellinjer baserat på dess princip, samtidigt som en enda-nukleotid upplösning.
Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av ett eCLIP-protokoll anpassat för mus testis. Kortfattat, detta eCLIP protokollet börjar med UV-crosslinking av testikeltubuli, följt av partiell RNase mat smältning och immunonederbörd med hjälp av en proteinspecifik anti kropp. Nästa, proteinet-bundet RNA är defosforylated, och adaptern är liga turer till dess 3 '. Efter protein gel elektrofores och gel-till-membran överföring, RNA isoleras genom att skära membranet området i en förväntad storleks intervall. Efter RT, DNA-adapter är liga turer till 3 ' slutet av cDNA följt av PCR amplifiering. Screening av subkloner före hög genom strömning sekvensering tas som ett bibliotek kvalitets kontroll. Detta protokoll är effektivt på att identifiera viktiga arter av protein-bundet RNA av RBPs, exemplifieras av de två testis-uttrycker RNA Helikas MOV10L1 och MOV10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

Spermatogenes definierar en högt beställd process av manlig köns cell differentiering hos däggdjur. I testis, transkription och översättning är okopplade, understryker vikten av post-transkriptionell reglering av gen uttryck iscensatt av RBPs. För att belysa mekanistiska roller i en RBP, crosslinking immunutfällning (CLIP) metodik kan användas för att fånga dess endogena direkt RNA mål och definiera de faktiska interaktions platser. Den förstärkta CLIP (eCLIP) är en nyutvecklad metod som erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella CLIPs. Dock har användningen av eCLIP hittills begränsats till cellinjer, vilket kräver utökade tillämpningar. Här använde vi eCLIP för att studera MOV10 och MOV10L1, två kända RNA-bindande helicases, i mus testis. Som väntat, finner vi att MOV10 huvudsakligen binder till 3 "oöversatta regioner (UTRs) av mRNA och MOV10L1 selektivt binder till piwi-interagerande RNA (piRNA) föregångare transkriptioner. Vår eCLIP metod tillåter snabb bestämning av stora RNA arter bundna av olika RBPs via småskalig sekvensering av subkloner och därmed till gång till kvalificerade bibliotek, som en teckningsoption för att fortsätta med djup sekvensering. I denna studie fastställs en tillämplig grund för eCLIP i testis i däggdjurs celler.

Eclip-förfarandet och resultaten illustreras i figur 1, figur 2, figur 3, figur 4. Möss var euthanized med koldioxid och ett litet snitt gjordes i nedre delen av buken med hjälp av kirurgiska saxar (figur 2A,B). Mus testi...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Förbättrad crosslinking Immunutfällning (eCLIP) metod för effektiv identifiering av protein-bundet RNA i mus testis

Här presenterar vi ett eCLIP-protokoll för att fastställa viktiga RNA-mål för RBP-kandidater i testis.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA-bindande proteiner är avgörande för cellulär fysiologi. Viktigt, RBP är mycket uttryckt i hela spermatogenesen och har varit väldokumenterade som väsentliga post-transkriptional regulatorer under alla stadier av könsceller. Identifiering av bindande mål är avgörande för att klarlägga de mekanistiska rollerna för RBP.Detta protokoll representerar en anpassad tillämpning av eCLIP-metoden för att fånga upp endogena direkta RNA-mål och fastställer en tillämplig grund för eCLIP i testis från däggdjur. Den största fördelen med denna metod är att den är icke-radioaktiv, mindre tidsintensiv, och ger ett starkare signal-brusförhållande eftersom den storleksanpassade insatsen kommer att fungera som en lämplig bakgrund för autentiska mål. Slutligen anser vi att småskalig sekvensering av subkloner är användbara för att följa djup sekvensering.Demonstrerar proceduren blir Xu Qiushi, min kollega. För att påbörja detta förfarande, skörda ca 100 milligram testiment från möss i lämplig ålder för varje immunprecipitation experiment. Placera vävnaderna i iskall PBS.Med hjälp av ett par finspetsade pincett, ta försiktigt bort tunica albuginea. Tillsätt tre milliliter iskall PBS till en vävnadskvarn, och använd en lös glas mortelstöt för att triturate vävnaden med mild mekanisk kraft. Därefter överför vävnadsupphängningen till en cellodlingsrätt och tillsätt iskall PBS upp till sex milliliter.Skaka plattan snabbt så att vätska täcker botten av skålen jämnt. Tvärlänka upphängningen på is tre gånger med 400 millijoule per centimeter i kvadrat vid 254 nanometer. Se till att blanda upphängningen mellan varje bestrålning.Samla sedan upphängningen i ett koniskt rör på 15 milliliter och centrifug vid 1, 200 gånger g och vid fyra grader i fem minuter. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av PBS. Efter detta överför du suspensionen till ett 1,5 milliliter centrifugrör.Centrifugera vid 1, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i två minuter, och kassera supernatanten. Tillsätt först 125 mikroliter protein A magnetiska pärlor per prov till en färsk centrifugrör. Placera röret på magneten för att separera pärlorna från lösningen.Efter 10 sekunder, ta bort supernatanten och tvätta pärlorna två gånger med en milliliter iskall lysbuffert. Resuspend pärlorna i 100 mikroliter av kall lysbuffert med 10 mikrogram eCLIP antikropp. Rotera rören i rumstemperatur i 45 minuter.Sedan tvätta pärlorna två gånger med en milliliter iskall lysbuffert. Till att börja med, resuspend vävnaden pellets i en milliliter av kall lys buffert som innehåller 22 mikroliter av 50x EDTA-fri proteinhämmare cocktail och 11 mikroliter av RNase-hämmare. Fortsätt att hålla proverna på is i 15 minuter.Sonikera varje prov enligt skiss i textprotokollet. Därefter lägger du till fyra mikroliter av DNase till varje rör och blanda väl. Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter medan du skakar vid 1, 200 rpm.Efter detta, tillsätt 10 mikroliter av utspädd RNase och blanda väl. Inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter medan du skakar vid 1, 200 rpm. Sedan centrifug vid 15, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i 20 minuter för att rensa lysate.Samla försiktigt supernatanten, och spara indataprover för RWB- och RRI-prover. Lägg först till en milliliter av lysate till de beredda pärlorna och rotera proverna vid fyra grader Celsius i antingen två timmar eller över natten. Efter detta, samla pärlorna med ett magnetiskt stativ, och kassera supernatanten.Tvätta pärlorna två gånger med 900 mikroliter av högsaltbuffert, och tvätta sedan pärlorna två gånger med 900 mikroliter av tvättbuffert. Tvätta sedan pärlorna en gång med 500 mikroliter av 1x defosforyleringsbuffert. Först, kasta supernatanten, och använd fina pipettspetsar för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska.Tillsätt 25 mikroliter av tre-prime ligatur master mix till varje prov, och noggrant pipetter att blanda. Lägg till 2,5 mikroliter RNA-adapter X1A och 2,5 mikroliter RNA-adapter X1B till varje prov. Blanda försiktigt genom pipettering eller snärtning.Inkubera vid 25 grader Celsius i 75 minuter, se till att snärta röret för att blanda var 10: e minut. Tvätta pärlorna en gång med 500 mikroliter av kalltvättbuffert. Därefter tvätta pärlorna en gång med 500 mikroliter av kall högsaltbuffert och sedan med 500 mikroliter kalltvättbuffert.Upprepa båda dessa tvättar en gång till. Magnetiskt separera pärlorna, och använd fina pipettspetsar för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska. Resuspend pärlorna i 100 mikroliter av kalltvätt buffert, och flytta 20 mikroliter till nya rör som RWB prover.Tillsätt 7,5 mikroliter av 4x LDS-provbuffert och tre mikroliter av 10x provreducerande medel till de återstående proverna. Inkubera vid 70 grader Celsius i 10 minuter medan du skakar vid 1, 200 rpm. Efter detta, kyl proverna på is i en minut, och centrifug på 1, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i en minut.För RWB gel, placera rör på en magnet, och separat protein eluater från pärlorna. Ladda 15 mikroliter prov i varje brunn. Därefter lägger du till 500 mikroliter antioxidant till 500 milliliter 1x SDS-körbuffert.Kör gelen på 200 volt, 1x SDS-körbuffert i 50 minuter eller tills färgämnesfronten är nederst. Överför protein-RNA-komplexen från gelen till ett nitrocellulosamembran vid 10 volt i 70 minuter i 1x överföringsbuffert med 10%metanol. Blockera RWB-membranet i 5%mjölk i TBST i rumstemperatur i en timme.Skölj membranet i TBST, och inkubera med primär antikropp i TBST över natten vid fyra grader Celsius. Efter detta, tvätta två gånger med TBST, med varje tvätt som varar fem minuter. Inkubera med sekundär antikropp i TBST vid rumstemperatur i en timme.Sedan, tvätta membranet tre gånger med TBST. Därefter blanda lika stora volymer av ECL buffert A och buffert B.Lägg till denna blandning till membranet, och inkubera i en minut. Täck membranet med plastfolie, och utsätta den för en röntgenfilm i rumstemperatur i två till tre minuter innan du utvecklar filmen.I denna studie, MOV10 eCLIP i testikor från vuxna vild-typ möss med RNase I behandla den tvärbindade lysate, målet protein, som är cirka 114 kilodalton, är framgångsrikt berikas. QPCR-resultaten av cDNA spädde en till 10 från olika prover visar att icke-crosslinked prover visar minskad RNA återhämtning. Det observeras att den icke-tvärlänkade gruppens Ct-värden i allmänhet är fem gånger mer än UV-korslänkad grupp.Representativa resultat för PCR-förstärkning och storleksval via agarosgelelektrofores visas här. Primer-dimer produkten visas på cirka 140 baspar. Ucsc Genome Browser-vyn av två representativa subclonesekvenser visar att MOV10-bundna eCLIP-taggar visar sig vara placerade inom den treprimeUTR av genen Fto.Den ungefärliga andelen treprime-UTR-mål står för 75 %, överensstämmer med majoriteten av MOV10-målen i HEK293-celler och i testikör. Däremot MOV10L1-bundna eCLIP-taggar visar sig vara placerade inom ett piRNA-kluster, vilket indikerar MOV10L1 mål piRNA prekursorer. Den ungefärliga andelen piRNA-prekursormål står för 42 %, vilket återspeglar en trend från tidigare studier.MOV10L1 eCLIP med en 40-enhet-per-milliliter RNase I matsmältningen ger relativt fler sekvenser med mindre än 20 baspar. Detta protokoll som här beskrivas, föreställer en anställning av eCLIP-metoden i reproduktion, ett område som RNAEN-RBP växelverkan kunskap är snarlikt otillräckligt.

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Effektiv Kromatin Immunoprecipitation med begränsande mängder av biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifiering av proteininteraktioner Partners i däggdjursceller med användning SILAC-immunoprecipitation Kvantitativa Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In vivo mikroinjektion och elektroporation av Mus Testikel

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Förbättrad Northern blot detektering av små RNA arter i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...