Name: enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Biz orijinal protokol ile yararlı rehberlik için Eric L Van Nostrand ve gene W Yeo teşekkür ederiz. K.Z. Ulusal anahtar R & D programı Çin (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) ve Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (31771653) tarafından desteklenmektedir. Ly Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (81471502, 31871503) ve yenilikçi ve girişimcilik programı Jiangsu Eyaleti tarafından desteklenmektedir.

Yapılan tüm hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmıştır. Erkek C57BL/6 fareler kontrollü fotoperiyodun koşullarında tutulur ve gıda ve su ile birlikte verildi.
1. doku hasat ve UV Crosslinking
<ol><li>1-2 dk veya solunum durur kadar karbondioksit (CO2) kullanarak 2 yetişkin fareler euthanize. Ardından, her fare üzerinde servikal çıkığı gerçekleştirin.</li>
	<li>Her immünoprecipitation deney için uygun yaş fareler (Bu çalı?...

<ol>
	<li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids.">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li><li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells.">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li><li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+right+RNA:+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins.">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li><li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li><li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+(piRNA)+pathway.">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li><li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation.">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li><li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition.">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li><li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells.">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication.">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li><li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor.">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li><li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data.">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).</li><li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain.">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).</li><li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity.">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitored+eCLIP:+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions.">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li><li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP:+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution.">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution.">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins.">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+(STAgR).">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li><li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools.">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis.">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+is+an+RNA-binding+protein,+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly.">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li><li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression.">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li><li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+(CLIP-Seq)+for+mouse+Piwi+proteins.">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li></ol>

Hem biyolojik hem de patolojik bağlamlar altında rbps evrensel rolünü anlamak artan, klip yöntemleri yaygın rbps moleküler fonksiyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır20,32,33, 34,35. Burada açıklanan protokol, fare testis için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder.
Testis içinde Eclip ...

Mammalian testis bir karmaşık hücre farklılaşma programı cyclically çok sayıda spermatozoa verim çalışır burada mükemmel bir gelişimsel model temsil eder. Bu modelin benzersiz bir değeri, genellikle Mayoz bölünmenin seks kromozom inaktivasyonu (MSCI)1,2 ve yuvarlak spermatids geçmesi zaman oluşur spermatogenesis belirli aşamalarında transkripsiyonel inaktivasyonu ortaya çıkması yatıyor spermiogenesis sırasında şiddetli nükleer sıkıştırma3. Bu ardışık transkripsiyonel olaylar, RNA bağlayıcı proteinlerin (rbps) transscriptome şekillendirme ve Erkek fertilitesini sürdürmek için önemli bir rol oynadığı transkripsiyon sonrası gen düzenlemesini gerektirmektedir.
Tek bir RBP in vivo ın bona fide RNA hedeflerini belirlemek için, çapraz immünoprecipitation (klip) yöntemi4,5, dayalı ancak normal RNA immünoprecipitation (RIP), istinaden geliştirilmiştir5/6 , ultraviyole (UV) Crosslinking, sıkı yıkama ve jel transferi dahil olmak üzere önemli adımlar eklenmesi ile sinyal özgüllüğü geliştirmek için. KLIBIN yüksek verimlilik sıralaması ile birlikte gelişmiş uygulaması, genom çapında8düzeylerinde PROTEIN-RNA etkileşiminin profiline büyük ilgi yarattı. RBP fonksiyonunda genetik çalışmalarda ek olarak, endojen proteinin ve RNA 'nın doğrudan etkileşimlerini belirleyen bu tür biyokimyasal Yöntemler, RBPs 'in RNA düzenleyici rollerini doğru bir şekilde elükte etmek için vazgeçilmez olmuştur. Örneğin, MOV10L1 erkek fertilite ve Piwi etkileşim RNA (piRNA) biyogenesis9için gerekli olan bir TESTIS özgü RNA helikaz olduğunu. Onun Parme MOV10 RNA biyoloji10,11,12,13,14 birden fazla açıdan roller ile bir her yerde ifade ve çok fonksiyonlu RNA helikazı olarak bilinir , 15 , 16 , 17 , 18. geleneksel klip-Seq istihdam ederek, biz MOV10L1 bağlar ve erken Pirna işleme19,20başlatmak için birincil Pirna öncüleri düzenler ve MOV10 mRNA 3 ' utrs ve yanı sıra kodlamayan RNA bağlar bulundu Testis germ hücrelerinde türler (veri gösterilmez).
Yine de, CLıP orijinal bir zahmetli, radyoaktif prosedür KLIPS etiketleri dikkat çekici bir kaybı ile dizi kitaplık hazırlama izledi. Geleneksel KLIPS 'de, her iki RNA ekstremitesinde birleştirilmiş adaptörler kullanılarak cDNA Kütüphanesi hazırlanır. Protein sindirimi sonrasında, çapraz bağlantılı kısa polipeptit RNA parçalarına bağlı kalır. Bu çapraz işareti kısmen blok ters transkriptaz (rtase) ilerlemesi cDNA sentezi sırasında, yaklaşık 80% cDNA Kütüphanesi21,22temsil eden kesilmiş cdnas sonuçlanan. Bu nedenle, yalnızca cDNA parçaları (okuma-through) çapraz bağlantı sitesi atlayarak RTase kaynaklanan sıralanmış. Son zamanlarda, PAR-CLıP, ıclip, eCLIP ve uvCLAP gibi çeşitli CLıP yaklaşımlar, yaşam hücrelerinde RBPs Crosslink sitelerini tanımlamak için istihdam edilmiştir. PAR-CLıP 365 Nm UV radyasyon ve photoactivatable nüklitid analogları uygulama içerir ve bu nedenle içinde-kültür yaşam hücrelerine özeldir, ve yeni sentezlenmiş transkriptler içine nükliside analogların birleşmesi önyargı üreten eğilimli RNA fiziksel olarak protein23,24ile etkileşime girer. Iclip 'de, sadece tek bir adaptör, çapraz bağlı RNA parçalarının 3 ' ekstremite için bağlanır. Ters transkripsiyon (RT) sonrasında, hem kesilmiş hem de okunan cdnas, intramolecularly döngülü ve yeniden doğruylama ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu tarafından elde edilir25,26. Ancak, intramoleküler devre verimliliği nispeten düşüktür. Eski CLIP protokolleri bir radyoizotop ile çapraz bağlı RNA etiketleme gerekir rağmen, ultraviyole çapraz ve yakınlık arıtma (uvclap), sıkı tandem benzeşme arıtma bir süreç ile, radyoaktivite27güvenmez. Yine de, uvclap tandem benzeşimi arıtma için 3x Flag-HBH etiketini taşıyan ifade vektörü ile transfekte olmalıdır kültürlü hücreler ile sınırlıdır.
ECLIP 'de, adaptörler ilk olarak RNA 'nın 3 ' ekstremite altında RT 'nin ardından, sonra da cDNAs 'ın 3 ' ekstremite içinde moleküllü bir modda bağlanıldı. Bu nedenle, eCLIP tüm kesilmiş ve okunan cDNA28ile yakalamak mümkün. Ayrıca, ne radyoaktif etiketleme sınırlıdır, ne de kendi ilkesine göre hücre hatları kullanarak, tek nüklemotid çözünürlüğü korurken.
Burada, fare testis için uyarlanmış bir eCLIP protokolünün adım adım açıklamasını sağlıyoruz. Kısaca, bu Eclip protokolü, testis tübüllerin UV çapraz ile başlar, kısmi RNase sindirim ve immünoprecipitation bir protein özgü antikor kullanarak izledi. Sonra, protein bağlı RNA dephosphorylated, ve adaptör 3 ' sonuna bağlanır. Protein jeli Elektroforez ve jel-membran transferinden sonra RNA, beklenen bir boyut aralığının membran alanını keserek izole edilir. RT sonra, DNA adaptörü PCR amplifikasyon tarafından izlenen cDNA 3 ' sonuna bağlandı. Yüksek verimlilik sıralamasının öncesinde subklonlar taraması Kütüphane kalite kontrolü olarak alınır. Bu protokol, iki testis ifade RNA helikazlar MOV10L1 ve MOV10 tarafından örneklenmiş rbps protein bağlı RNA büyük türlerin belirlenmesi, etkilidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:804px;" width="804">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antibodies</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">Anti-mouse MOV10&#160; antibody</td>
			<td style="width:180px;">Proteintech, China</td>
			<td style="width:171px;">10370-1-AP</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:229px;">Anti-mouse MOV10L1 antibody</td>
			<td style="width:180px;">Zheng et al.20109</td>
			<td style="width:171px;">polyclonal antisera UP2175</td>
			<td style="width:224px;">provided by P. Jeremy Wang lab&#65288;University of Pennsylvania&#65289;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HRP Goat Anti-Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ABclonal</td>
			<td style="width:171px;">AS014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Beyotime, China</td>
			<td style="width:171px;">A7016</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Equipment</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:171px;">5242R</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:180px;">BRANSON,USA</td>
			<td style="width:171px;">BBV12081048A</td>
			<td style="width:224px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">12321D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Blot Module</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">B1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mini Gel Tank</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">A25977</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>Thermomixer comfort&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>PYREX, USA</td>
			<td>1234F35</td>
			<td style="width:224px;">only&#160; the &#34;loose&#34; pestle is used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">TProfessional standard 96 Gradient</td>
			<td style="width:180px;">Biometra, Germany</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 2604323</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:171px;">serial no.: 3406051</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:171px;">CL-1000</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430167</td>
			<td style="width:224px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:171px;">430791</td>
			<td style="width:224px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:180px;">AXYGEN , USA</td>
			<td style="width:171px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:224px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:229px;">Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Solarbio, China</td>
			<td style="width:171px;">P1011</td>
			<td style="width:224px;">25:24:01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">AffinityScript Enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:171px;">600107</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Antioxidant</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0005</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:229px;">DH5&#945; competent bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>18265017</td>
			<td style="width:224px;">these economical cells yield &#62;1 x 106 transformants/&#181;g control DNA per 50 &#181;L reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DMSO</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">D8418</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">DNA Ladder</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">10416014</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dNTP</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">DNTP100-1KT</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>10002D</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL reagent</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>E411-04</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9260G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:180px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:171px;">04693132001</td>
			<td style="width:224px;">add fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Exo-SAP-IT</td>
			<td style="width:180px;">Affymetrix, USA</td>
			<td style="width:171px;">78201</td>
			<td style="width:224px;">PCR Product Cleanup Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">FastAP enzyme</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">EF0652</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0007</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MetaPhor Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">lonza, Switzerland</td>
			<td style="width:171px;">50180</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:229px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9530G</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:229px;">MiniElute gel Extraction</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">28604</td>
			<td style="width:224px;">column store at 4 &#8451;; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MyONE Silane beads</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td>37002D</td>
			<td style="width:224px;">nucleic acids extraction magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NP-40</td>
			<td style="width:180px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:171px;">M158-500ML</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0336BOX</td>
			<td style="width:224px;">4%&#8211;12%,1.5 mm, 15-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&#160;&#160;</td>
			<td style="width:180px;">TIANGEN, China</td>
			<td style="width:171px;">WM5-2302831</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:180px;">Applied Biosystems, USA</td>
			<td style="width:171px;">A25742</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">proteinase K</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">P8107S</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Q5 PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0492L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RLT buffer</td>
			<td style="width:180px;">QIAGEN, Germany</td>
			<td style="width:171px;">79216</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5 columns&#160;</td>
			<td style="width:180px;">ZYMO RESEARCH, USA</td>
			<td style="width:171px;">R1016</td>
			<td style="width:224px;">RNA purification and concentration columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase I&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">AM2295</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:171px;">N251B</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">RQ1 DNase</td>
			<td style="width:180px;">Promega,USA</td>
			<td style="width:171px;">M610A</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">NP0009</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">SDS Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:171px;">15553027</td>
			<td style="width:224px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">30970</td>
			<td style="width:224px;">protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 PNK enzyme</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0201L</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">T4 RNA ligase 1 high conc</td>
			<td style="width:180px;">NEB, New England&#160;</td>
			<td style="width:171px;">M0437M</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td>
			<td style="width:180px;">Vazyme, China</td>
			<td style="width:171px;">C601-01</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TBE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td style="width:171px;">AM9863</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600198&#160;</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:171px;">A600560</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Urea</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:171px;">U5378</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">X-ray Films</td>
			<td style="width:180px;">Caresteam, Canada</td>
			<td style="width:171px;">6535876</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced crosslinking immunoprecipitation (eclip) method for efficient identification of protein-bound rna in mouse testis

Spermatogenesis, memelilerde erkek germ hücresi farklılaşma yüksek sipariş edilen bir süreç tanımlar. Testis, transkripsiyon ve çeviri unoupled, RBPs tarafından düzenlenmiş Gen ifadesinin Post-transcriptional düzenleme önemini vurgulayarak. Bir RBP 'nin mekanik rollerini yenilemek için, endojen doğrudan RNA hedeflerini yakalamak ve gerçek etkileşim sitelerini tanımlamak için çapraz bağlama immünopresipitasyon (CLIP) metodolojisi kullanılabilir. Gelişmiş CLıP (eCLIP), geleneksel klipler üzerinde çeşitli avantajlar sunan yeni geliştirilen bir yöntemdir. Ancak, eCLIP kullanımı şimdiye kadar genişletilmiş uygulamalar için arama, hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Burada, biz MOV10 ve MOV10L1, iki RNA-bağlayıcı helicases, fare testis okumak için eCLIP istihdam. Beklendiği gibi, biz MOV10 ağırlıklı olarak mRNA 3 ' tercüme edilmemiş bölgelere (UTRs) bağlar ve MOV10L1 seçmeli olarak Piwi-etkileşim RNA (piRNA) öncüsü transkriptler bağlar bulabilirsiniz. ECLIP yöntemimiz, alt klonların küçük ölçekli sıralaması ve böylece nitelikli kütüphanelerin kullanılabilirliği ile çeşitli RBPs 'lerin bağlı olduğu büyük RNA türlerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ve bu da derin sıralamaya devam etmek için bir emir olarak kullanılabilir. Bu çalışma, memeliyen testis içinde eCLIP için geçerli bir temel kurar.

Eclip prosedürü ve sonuçları Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4' te gösterilmiştir. Fareler karbondioksit ile ötenize edildi ve cerrahi makas kullanılarak alt karın içinde küçük bir kesi yapılmıştır (Şekil 2a,B<...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis at JoVE.com

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation eCLIP Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA bağlayıcı proteinler hücresel fizyoloji için gereklidir. Daha da önemlisi, RBP yüksek spermatogenez boyunca ifade edilir ve iyi mikrop hücrelerinin tüm aşamalarında gerekli post-transkripsiyonel düzenleyiciler olarak belgelenmiştir. Bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi RBP'nin mekanik rollerini açıklamak için çok önemlidir.Bu protokol, endojen direkt RNA hedeflerini yakalamak için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder ve memeli testlerinde eCLIP için geçerli bir temel oluşturur. Bu yöntemin en büyük avantajı, radyoaktif olmayan, daha az zaman yoğun olması ve boyut uyumlu giriş otantik hedefler için uygun bir arka plan olarak hizmet edeceği için daha güçlü bir sinyal-gürültü oranı sağlamasıdır. Son olarak, alt klonların küçük ölçekli sıralama derin sıralama aşağıdaki yararlı olduğunu düşünüyorum.Prosedürü gösteren Xu Qiushi, meslektaşım olacak. Bu prosedüre başlamak için, her immünoprepitasyon deneyi için uygun yaştaki farelerden yaklaşık 100 miligram testis hasat edin. Dokuları buz gibi PBS'ye yerleştirin.İnce uçlu cımbız bir çift kullanarak, yavaşça tunaica albuginea kaldırın. Bir doku öğütücüse üç mililitre buz gibi PBS ekleyin ve hafif mekanik kuvvetle doku triturate gevşek bir cam havaneli kullanın. Daha sonra, bir hücre kültür çanak doku süspansiyon aktarın ve altı mililitre kadar buz gibi PBS ekleyin.Sıvı eşit yemeğin alt kapakları böylece hızlı bir şekilde plaka sallayın. 254 nanometre kare santimetre kare 400 milijoule ile buz üzerinde süspansiyon üç kez Crosslink. Süspansiyonu her ışınlama arasında karıştırdığından emin olun.Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde süspansiyon toplamak ve santrifüj 1, 200 kez g ve beş dakika boyunca dört derece. Supernatant çıkarın ve PBS bir mililitre pelet resuspend. Bundan sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp süspansiyon aktarın.Santrifüj 1, 000 kez g ve iki dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant atın. İlk olarak, taze bir santrifüj tüpüne numune başına 125 mikrolitre protein ekleyin. Çözelti boncukayırmak için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin.10 saniye sonra, supernatant çıkarın ve buz gibi lysis tampon bir mililitre ile iki kez boncuk yıkayın. 10 mikrogram eCLIP antikor ile 100 mikrolitre soğuk lysis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Tüpleri oda sıcaklığında 45 dakika döndürün.Daha sonra boncukları bir mililitre buz gibi lysis tamponuyla iki kez yıkayın. Başlamak için, 50x EDTA içermeyen protein inhibitörü kokteyl22 mikrolitre ve RNase inhibitörü 11 mikrolitre içeren soğuk lysis tampon bir mililitre doku pelet resuspend. Örnekleri 15 dakika buzüzerinde inceleyin.Metin protokolünde belirtildiği gibi her örneği sonicate. Sonra, her tüp e dört mikrolitre DNase ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Bundan sonra, seyreltilmiş RNase 10 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Sonra, 15, 000 kez g ve lysate temizlemek için 20 dakika boyunca dört derece santigrat santrifüj.Supernatant'ı dikkatlice toplayın ve giriş örneklerini RWB ve RRI örnekleri için kaydedin. İlk olarak, hazırlanan boncuklara bir mililitre lysat ekleyin ve numuneleri iki saat veya gece boyunca dört derece olarak döndürün. Bundan sonra, manyetik bir stand ile boncuk toplamak ve supernatant atın.900 mikrolitre yüksek tuz tamponu yla boncukları iki kez yıkayın ve 900 mikrolitre yıkama tamponuyla boncukları iki kez yıkayın. Daha sonra boncukları 500 mikrolitre 1x defosforilasyon tamponu ile bir kez yıkayın. İlk olarak, supernatant atın ve herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için ince pipet ipuçları kullanın.Her numuneye 25 mikrolitre üç asal ligasyon ana karışımı ekleyin ve karıştırmak için dikkatlice pipet. Her numuneye 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1A ve 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1B ekleyin. Pipetleme veya hareket ettirerek dikkatlice karıştırın.75 dakika boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatarak tüpün her 10 dakikada bir karıştırıldığından emin olun. Boncukları 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponuyla bir kez yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre soğuk yüksek tuz tamponu ve ardından 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponu ile yıkayın.Bu yıkıntıların her ikisini de bir kez daha tekrarlayın. Boncukları manyetik olarak ayırın ve artık sıvıyı çıkarmak için ince pipet uçları kullanın. Soğuk yıkama tampon 100 mikrolitre boncuk resuspend ve RWB örnekleri olarak yeni tüpler için 20 mikrolitre taşıyın.Kalan numunelere 7,5 mikrolitre 4x LDS numune tamponu ve üç mikrolitre 10x numune azaltma maddesi ekleyin. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, bir dakika buz üzerinde örnekleri serin ve 1.000 kez g ve bir dakika için dört derece santigrat de santrifüj.RWB jel için, bir mıknatıs üzerine tüpler yerleştirin ve ayrı protein boncuklar eluate. Her kuyuya 15 mikrolitre numune yükleyin. Daha sonra, 500 mililitre 1x SDS çalışan tampon antioksidan 500 mikrolitre ekleyin.Jel i çalıştırın 200 volt, 1x SDS 50 dakika veya boya ön alt kadar tampon çalışan. Protein-RNA komplekslerini jelden nitroselüloz membrana 10 volt'ta 70 dakika boyunca 1x transfer tamponuna %10 metanol ile aktarın. Bir saat oda sıcaklığında TBST% 5 süt RWB membran blok.TBST membran durular ve dört santigrat derece tbst bir gecede birincil antikor ile inkübat. Bundan sonra, TBST ile iki kez yıkayın, her yıkama beş dakika süren. Bir saat oda sıcaklığında TBST ikincil antikor ile kuluçka.Daha sonra, TBST ile membran ı üç kez yıkayın. Daha sonra, eşit hacimlerde ECL tampon A ve tampon B.Bu karışımı membrana ekleyin ve bir dakika kuluçkaya yatırın. Membranı plastik sargı ile kapatın ve filmi geliştirmeden önce oda sıcaklığında 2-3 dakika x-ray filmine maruz bırakın.Bu çalışmada, RNase I ile erişkin yabani tip farelerin testislerinde MOV10 eCLIP çapraz bağlı lysate tedavi, hedef protein, yaklaşık 114 kilodaltons, başarıyla zenginleştirilmiştir. Çeşitli örneklerden 1-10 arasında seyreltilmiş cDNA'nın qPCR sonuçları çapraz bağlanmamış örneklerde azalmış RNA geri kazanımı olduğunu ortaya koymaktadır. Çapraz bağlı olmayan grubun Ct değerlerinin genellikle UV-crosslinked grubundan beş kat daha fazla olduğu gözlenmiştir.Agarose jel elektroforez ile PCR amplifikasyon ve boyut seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Astar-dimer ürün yaklaşık 140 baz çifti görünür. UCSC Genom Tarayıcısı'nın iki temsili subklon dizisi görünümü, MOV10'a bağlı eCLIP etiketlerinin Fto geninin üç asal UTR'si içinde bulunduğunu göstermektedir.Üç asal UTR hedeflerinin yaklaşık oranı %75'tir hek293 hücrelerindeki ve testislerde bulunan MOV10 hedeflerinin çoğuyla tutarlıdır. Buna karşılık, MOV10L1 bağlı eCLIP etiketleri bir piRNA kümesi içinde bulunan bulunur, MOV10L1 hedefleri piRNA öncüleri gösteren. PiRNA öncül hedeflerinin yaklaşık oranı önceki çalışmalardan gelen bir eğilimi yansıtan %42'yi oluşturmaktadır.MOV10L1 mililitre başına 40 birimlik RNase I sindirim ile eCLIP az 20 baz çiftleri ile nispeten daha fazla dizileri verir. Burada açıklanan bu protokol, RNA-RBP etkileşim bilgisinin yetersiz olduğu bir alan olan çoğaltmada eCLIP yönteminin istihdamını temsil eder.

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...