Name: using near-infrared fluorescence and high-resolution scanning to measure protein expression in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain at JoVE.com

この報告書の研究は、DK に授与される NIGMS (1P20GM103653) の助成金によって賄われた。

次のプロトコルは、デラウェア大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) によって承認されました。男性スプレイグスプラーグラット約 55-75 日は、このプロトコルのために使用されました。
1. 脳の抽出と組織の準備
<ol><li>ラットが麻酔誘導チャンバ内のイソフルランを有する麻酔ラットはもはや足のピンチに対する反応を示さない。</li>
	<li>ギロチンを使用して急速な...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).</li><li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2/3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion.">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li><li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+(CRH)+mediate+anxiety-like+behaviors?+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release.">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li><li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS/MS+for+label-free+quantitation.">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li><li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients.">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).</li><li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+methods+and+protocols.">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies.">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li><li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress.">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li><li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits.">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning &amp; Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+resolution+near+infrared+imaging+to+measure+fear-learning+induced+changes+in+AMPA/NMDA+ratios+throughout+the+fear+circuit.">Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit.</a> , (2018).</li><li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels.">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li></ol>

この記事では、近赤外免疫細胞化学を高解像度スキャニングと組み合わせて使用することで、脳組織におけるタンパク質発現の半定量的な測定値を得ることができることを示しています。また、同じ脳領域で同時に2つのタンパク質を標識するために使用することができます.我々は以前、近赤外免疫組織化学を用いて、複数の脳領域9,10における早?...

神経科学の研究は、脳内の細胞が特定の機能1を媒介する方法の調査に関するものです。これらは、グリア細胞が中枢神経系において免疫を与える方法などの性質の細胞であるか、または背部海馬におけるニューロンの活性が空間的なナビゲーションをもたらす方法を説明することを目的とする実験を伴うことができる。広い意味では、細胞機能は、セル内で発現されているタンパク質およびこれらのタンパク質2の活性によって決定される。その結果、脳細胞におけるタンパク質の発現および/または活性の測定は、神経科学の研究にとって重要である。
脳内のタンパク質発現を測定するために、多くの技術が利用可能である。これらには、小ペプチド4の受容体密度3およびマイクロ透析のための陽電子放射地形などのインビボの方法が含まれる。より一般的には、ex vivo の方法は、タンパク質の機能および発現を検査するために使用される。これらには、質量分析技術5、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)6、および免疫細胞化学7が含まれる。免疫細胞化学は、神経科学の分野で広く使用されています。この技術は、一次抗体を使用して、目的のタンパク質 (または抗原) を検出する (例えば、c − Fos) および共役二次抗体がタンパク質-一次抗体複合体を検出することを含む (図 1)。タンパク質-一次抗体-二次抗体複合体の検出を可能にするために、二次抗体は、それらに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) などの酸化剤を有する。これにより、光顕微鏡7を使用して検出することができる細胞における析出物の形成を可能にする。二次抗体はまた、化学物質がそれらに共役して蛍光を発することができます (すなわち、蛍光色素)。これらの化学物質を刺激すると光が放出され、これはタンパク質-一次抗体-二次抗体複合体7を検出するために使用することができる。最後に、一次抗体は還元剤と蛍光性化学物質を結合させ、二次抗体の必要性を直接否定することがあります (図 1)。
興味深いことに、多くの免疫細胞化学方法は、脳細胞のタンパク質の可視化を可能にするが、特定の細胞または脳領域内のタンパク質の量を定量化する能力はない。還元反応からの析出物を検出するために光顕微鏡を使用することは、ニューロンおよびグリアの可視化を可能にするが、この方法は、細胞内または特定の脳領域におけるタンパク質発現を定量化するために使用することはできない。理論上、蛍光顕微鏡は、このために使用することができるが、蛍光性二次抗体から放出される光は、タンパク質−一次抗体−二次抗体複合体の尺度であるからである。しかしながら、脳組織における自己蛍光は、脳組織8におけるタンパク質発現を定量化するために蛍光顕微鏡を使用することを困難にすることができる。結果として、脳組織の蛍光画像から放出される光は、脳内のタンパク質発現を定量化するためにめったに用いられない。
これらの問題の多くは、高解像度スキャン9,10と共に近赤外免疫細胞化学を使用して対処することができます。本稿では、近赤外発光スペクトルの蛍光色素と結合した免疫細胞化学を高解像度スキャニング (例えば 10 ~ 21 μ m) と組み合わせることで、異なるタンパク質の半定量を可能にするシャープな画像を得る方法について述べる。脳領域。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:658px;" width="657">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:658px;">Brain Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td style="width:147px;">Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-0530SM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kleine Guillotine</td>
			<td style="width:147px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>73-1920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Friedman Rongeur</td>
			<td style="width:147px;">Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td>used to remove back of skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>used to cut upward along midline of skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Micro Spatula</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>used to scoop out brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:114px;">12-549-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:658px;">Immunohistochemical Reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;Triton X-100</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td>Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td>Used as a small amount of detergent added to TBS&#160; to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Licor Odyssey scanner</td>
			<td style="width:147px;">Licor Biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Image Studio</td>
			<td style="width:147px;">Licor Biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using near-infrared fluorescence and high-resolution scanning to measure protein expression in the rodent brain

神経科学は、脳内の細胞が様々な機能を媒介する方法の研究であります.ニューロンおよびグリアにおけるタンパク質発現の測定は、細胞機能が細胞タンパク質の組成および活性によって決定されるため、神経科学の研究にとって重要である。この記事では、免疫細胞化学を近赤外高解像度スキャンと組み合わせることで、異なる脳領域におけるタンパク質発現の半定量的測定値を提供する方法について説明します。この技術は、同じ脳領域内の単一または二重タンパク質発現に使用することができる。この方法でタンパク質を測定することにより、実験的操作、学習と記憶の分子シグネチャ、分子経路での活動、複数の脳領域における神経活動を伴うタンパク質発現の相対的変化を得ることができます。正しいタンパク質と統計解析を使用して、脳領域間の機能的な接続性も決定することができます。実験室で免疫細胞化学を実装する容易さを考えると、近赤外高解像度スキャンで免疫細胞化学を使用すると、神経科学者の能力を拡張して、システムレベルで神経生物学プロセスを調べることができます。

免疫組織化学の高解像度スキャンを使用する前に、プロトコルが動作することを確認する必要があります。これは、同じ動物からの脳切片が一次および二次抗体と共にインキュベートされる検証アッセイを用いて、二次抗体単独で、または一次でも二次抗体でも達成することができる。このような検証アッセイの結果を図 2に示す。この反応に?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain at JoVE.com

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

このプロトコルは、同じ脳領域内の2つのタンパク質の定量化を可能にするので、重要である。これにより、実験者は、パンおよびリンフォタンパク質をアッサングすることによって、脳領域における分子シグナル伝達経路の活性を調べることができる。また、異なる認知現象のマーカーであるタンパク質のアッセイにも使用できます。免疫検査などの比較的単純な手法を用いて、一般的により関与する技術を必要とする質問に答えています。分子シグナル伝達経路の活性を調べることを含む,AMPA/NMDA比を調べる。マイナス9度とマイナス12度の間に維持されたクライオスタットを使用して、30〜50マイクロメートルの関心領域で以前に単離され、凍結したラット脳をスライスする。ガラススライドに直接スライスを取り付け、免疫細胞化学までマイナス80度で保存します。冷凍庫からガラススライドを取り出し、室温まで30分間平衡させます。ヒュームフードの下で作業し、組織固定のために室温で1〜2時間0.1モルPBSで4%パラホルムアルデヒドにスライドを置きます。その後、0.1モルTBSでスライドを3回3回10分間すすます。細胞膜を透過させるには、中性洗剤でスライドを30〜60分間インキュベートする。そして、TBSで再び15分間3回すすいでください。原稿に記載されているように正しい濃度でPBSに関心のあるタンパク質に対する一次抗体を希釈する。ピペット一次抗体溶液を脳組織に直接。スライドにカバースリップを置き、一次抗体希釈液中の脳組織を室温で1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、カバースリップを取り外し、少量の洗剤を加えたTBSでスライドを洗浄し、それぞれ15分間4回洗浄します。TBS、洗剤、および1.5%の宿主血清を含む希釈二次抗体。二次抗体をスライドに加え、カバースリップで覆い、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、TBS-Tのスライドをそれぞれ20分間4回、TBSでそれぞれ20分間4回リンスします。暗闇の中で室温でスライドを乾燥させ、一晩乾燥させます。スライドを近赤外線スキャンインターフェースに配置し、組織を下に向けます。選択ツールを使用して、複数のスライドを一度にイメージ化します。解像度 21 マイクロメートルの最高品質設定を使用して、スライドをイメージします。ゼロナノメートルのオフセットで、画像分析ソフトウェアに画像をインポートして、半定量的タンパク質分析の表示とマークを付けます。画像解析ソフトウェアを開いた後、画像をスキャンした作業領域を選択します。次に、スキャンした画像を画像解析ソフトウェアで開き、スキャンを表示し、生画像または総定量化された放出を変更することなく、表示される波長、コントラスト、明るさ、および拡大率を調整します。定量の主要領域を特定したら、ページの上部にある解析タブを選択し、四角形を描画を選択して、定量化される領域に長方形を描画します。四角形のサイズを表示するには、画面の左下にある図形を選択します。次に、右下に沿って列を選択します。次に、高さと幅の列を追加して、図形のサイズを識別します。最後に、図形に名前を付けて繰り返します。すべての領域をサンプリングしたら、[列] タブで使用できるデータの結合と分析を続行します。このプロトコルが機能することを確認するために、脳切片を一次および二次抗体、二次抗体のみ、または一次抗体または二次抗体と共にインキュベートした。直ちに初期の遺伝子c-jun発現は、一次抗体と二次抗体の両方が脳組織に適用された場合にのみ、眼下海馬と扁桃体で検出された。NMDA受容体のAMPA受容体およびNR2AサブユニットのGluR1サブユニットは扁桃体核における便タンパク質検出においてアッセイした。これは、学習と記憶の神経生物学的シグネチャである扁桃体のサブ核におけるAMPA NMDA受容体の比率を調べることを可能にした。タンパク質発現の平均および正規化された尺度は、腹側海馬の高分解能スキャンから得られた。画像解析ソフトを用いて、形状からの光の対象領域と平均強度に矩形を配置し、タンパク質発現の尺度であるフルオロフォア発現の尺度として用いた。正規化曲線を得るために、曲線下の領域に高いシグナルと低い信号を発現する領域に形状を配置し、タンパク質発現の尺度として使用した。この手順で最大の闘争は、抗体を見つけて、それが動作することを確認することです。アプリケーションは簡単です。私のアドバイスは、まず定期的な免疫学的処置を試み、次にこの技術を試してみるとよいでしょう。常に検証アッセイを最初に実行する。覚えておくべきことは、抗体希釈を確認し、それが正しく適用されていることを確認することです。これらの手順を実行しないと、プロシージャは失敗します。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

齧歯類の脳における同時fMRIと電気生理学

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

神経科学

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

空間ナビゲーションで学習研究するために近赤外分光法をMazeSuiteおよび機能の使用

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy NIRS Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

近赤外線分光法 (NIRS) ニューロ イメージングを使用してグローバル発達を研究する神経イメージング研究フィールドのメソッド: サハラ以南アフリカの農村

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in ...