Name: application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed (Grants # AI122034 og AI140167) og New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).

1. fremstilling af proteiner
<ol><li>Brug en dialysepose (med en passende cut-off-størrelse) til at dialysere hvert protein, der skal anvendes til BLI assays (herunder både hans-mærkede ligand og analysand) mod 1.000 bind af BLI buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, forkølet til 4 °C) ved 4 °C i 4 timer. Bemærk: BLI-assays kræver, at ligand er til stede ved koncentrationer, der mægle bindings stederne på biosensoren og analytten, så de er meget rens...

<ol>
	<li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection.">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li><li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+sigma+factors:+a+historical,+structural,+and+genomic+perspective.">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li><li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bacterial+transcription+factors:+how+proteins+take+on+new+tasks,+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones.">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li><li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trachoma.">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections:+2008.">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li><li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children.">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li><li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse.">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li><li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry.">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li><li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia.">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li><li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li><li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li><li>Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).</li><li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation.">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li><li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+&#963;66.">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of &#963;66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li><li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+GrgA+in+regulation+of+&#963;28-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Role for GrgA in regulation of &#963;28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li><li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization.">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+(BIA).">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li><li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+(BIA/MS).">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li><li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance.">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li><li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole/glucose+oxidase+multilayers.">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li><li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions.">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li><li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors:+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications.">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects.">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li></ol>

Protein-protein interaktioner er afgørende for reguleringen af transkriptionen og andre biologiske processer. De er mest almindeligt undersøgt gennem rulle assays. Selv om rulle assays er relativt let at udføre, de er dårligt kvantitative og kan undlade at opdage svage, men biologisk meningsfulde interaktioner. Til sammenligning, ved at registrere real-time Association og dissociation mellem en ligand og en analysand, giver BLI sammenslutning og dissociation rate konstanter, samt, samlede affinitet.
<p class="jov...

Transskription, som producerer RNA-molekyler ved hjælp af DNA som skabelon, er det allerførste trin i genekspression. Bakteriel RNA syntese begynder efter binding af RNA polymerase (rnap) holoenzym til en Target Promoter1,2. Det RNAP holoenzym (RNAPholo) består af en multi-subunit katalytisk kerne (RNAPcore) og en σ faktor, som er nødvendig for at genkende arrangøren sekvens. Transskriptions aktivatorer og repressorer, kollektivt betegnet TFs, regulerer genekspression gennem bindings komponenterne i RNAPcore, σ-faktorerne og/eller DNA. Afhængig af organismen, en betydelig del af dens genom kan afsættes til TFs, der regulerer transkriptionen som reaktion på fysiologiske behov og miljømæssige signaler3.
Klamydia er en forpligte intracellulær bakterie, der er ansvarlig for en række sygdomme hos mennesker og dyr4,5,6,7,8. For eksempel, Chlamydia trachomatis er formentlig den nummer et seksuelt overført patogen hos mennesker over hele verden, og en førende årsag til blindhed i nogle underudviklede lande4,5. Klamydia har en unik udviklingsmæssige cyklus karakteriseret ved to vekslende cellulære former kaldes den elementære krop (EB) og reticulate krop (RB)9. Der henviser til, at EBs er i stand til at overleve i et ekstracellulært miljø, men at det er ude af stand til spredning. EBs indtaster værtsceller gennem endokytose og skelner i større RBs i en vakuole i værts cytoplasmaet inden for timer efter inokulation. Ikke længere smitsomt, RBs prolifererer gennem binær fission. Omkring 20 timer begynder de at skelne tilbage til EBs, som forlader værtscellerne omkring 30-70 h.
Progression af Chlamydia udviklingsmæssige cyklus reguleres af transkriptionen. Der henviser til, at et over flertal af de næsten 1.000 klamydial gener udtrykkes under den midt cyklus, hvor RBs aktivt replikaerer, men at kun et lille antal gener transskriberes umiddelbart efter, at EBs er indsat i værtscellerne for at påbegynde omdannelsen af EBs i RBs, og et andet lille sæt af gener er transskriberet eller i stigende grad transskriberet til at muliggøre differentiering af RBs i EBs10,11.
Chlamydia-genomet koder tre σ-faktorer, nemlig σ66, σ28 og σ54. σ66, som svarer til husholdning σ70 af E. coli og andre bakterier, er ansvarlig for at anerkende initiativtagere til tidlige og midt-cyklus gener samt nogle sene gener, hvorimod σ28 og σ54 er nødvendige for transkriptionen af visse sene gener. Flere gener er kendt for at bære både en σ66-afhængig promotor og en σ28-afhængig promotor12.
På trods af en kompliceret udviklingscyklus er der kun fundet et lille antal TFs i Chlamydiae13. GRGA (tidligere kommenteret som en hypotetisk protein CT504 i c. trachomatis blev D og CTL0766 i c. trachomatis L2) er en Chlamydia-specifikke TF oprindeligt anerkendt som en aktivator af σ66-afhængige gener14. Affinitets rulle assays har vist, at GRGA aktiverer deres transskription ved at binde både σ66 og DNA. Interessant nok blev det senere fundet med, at GrgA også co-udfældelse med σ28, og aktiverer transskription fra σ28-afhængige promotorer in vitro15. For at undersøge om GrgA har lignende eller forskellige tilhørsforhold til σ66 og σ28, tydede vi på at bruge bli. BLI assays har vist, at GrgA interagerer med σ66 ved en 30 gange højere affinitet end med σ28, hvilket tyder på, at GRGA kan spille differentialroller i σ66-afhængig transkription og σ28-afhængig transkription 15.
BLI detekterer interferens mønsteret af hvidt lys, der reflekterer fra et lag af immobiliseret protein på spidsen af en biosensor og sammenligner det med et internt reference lag16. Gennem analysen af disse to interferens mønstre kan BLI give værdifulde oplysninger i realtid om mængden af protein, som er bundet til spidsen af biosensoren. Proteinet, der er immobiliseret til spidsen af biosensoren kaldes ligand, og er generelt immobiliseret ved hjælp af en fælles antistof eller epitop tag (f. eks en poly-His-eller biotin-tag), der har en affinitet for en associeret partikel (såsom NTA eller Streptavidin) på spidsen af biosensoren. Bindingen af et sekundært protein, benævnt analysand, med ligand ved spidsen af biosensoren skaber ændringer i biosensorens opacitet og resulterer derfor i ændringer i interferens mønstre. Når BLI gentages over forskellige koncentrationer af analytten, kan den ikke blot levere kvalitative, men også kvantitative oplysninger om affiniteten mellem ligand og analysand16.
Vi var de første til at ansætte BLI til at karakterisere protein-protein interaktioner i transkriptionen15. I denne publikation viser vi, at et GrgA-fragment, der tidligere har vist sig at være nødvendigt for σ28-binding, faktisk formidler bindingen. Dette manuskript fokuserer på trin i BLI-assays, og generering af BLI grafer og parametre for bindende kinetik. Metoder til fremstilling (og rensning) af ligander og analytter er ikke dækket her.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BLItz machine</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Ni-NTA biosensor tray</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td>Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop holder</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>CLS6571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (black)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T095100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription

En transkriptionsfaktor (TF) er et protein, der regulerer genekspression ved at interagere med RNA-polymerase, en anden TF og/eller skabelon-DNA. GRGA er en roman transskription aktivator findes specifikt i forpligte intracellulære bakterielle patogen klamydia. Protein rulle assays ved hjælp af affinitets perler har afsløret, at GRGA binder to σ-faktorer, nemlig σ66 og σ28, som genkender forskellige sæt af promotorer for gener, hvis produkter differentielt kræves på udviklingsmæssige stadier. Vi har brugt BLI til at bekræfte og yderligere karakterisere samspillet. BLI demonstrerer flere fordele i forhold til rulle: 1) det afslører real-time Association og dissociation mellem bindende partnere, 2) det genererer kvantitative kinetiske parametre, og 3) det kan detektere bindinger, som rulle assays ofte undlader at opdage. Disse egenskaber har gjort det muligt for os at udlede de fysiologiske roller af GrgA i forordningen om genekspression i klamydiaog mulige detaljerede interaktions mekanismer. Vi forestiller mig, at denne relativt overkommelige teknologi kan være yderst nyttig til at studere transskription og andre biologiske processer.

Gennem BLI assays har vi tidligere fastslået, at binding af GrgA til σ28 er afhængig af en 28 aminosyre middelregion (rester 138-165) af GRGA15. Sammenlignet med N-terminalt hans-Tagged fuld længde GrgA (NH-GrgA), en GrgA sletning konstruktion mangler denne region (NH-GrgAΔ 138-165) havde en nedsat Association rate og en øget dissociation sats, hvilket førte til en 3.000.000-fold tab af samlede affinitet (tabel 1). Her viser vi, at denne midterste region binder ?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interaktioner af transkriptionsfaktorer (TFS) med RNA-polymerase er normalt undersøgt ved hjælp af rulle assays. Vi anvender en biolayer interferometri (bli) teknologi til at karakterisere samspillet mellem GRGA med Chlamydia RNA polymerase. Sammenlignet med rulle assays, registrerer bli real-time Association og dissociation, giver højere følsomhed, og er meget kvantitativ.

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Protein-protein interaktion i transskription er traditionelt blevet undersøgt ved hjælp af Por dialyse. Men Por dialyse er rent kvantitative. Vi bruger biolayer interferometri, eller BLI, at overvinde dette problem.Sammenlignet med Por dan, BLI registrerer real time forening og dissociation mellem limning partnere. Det genererer også kvantitative kinetiske parametre, som er tegn på interaktionsmekanismer. BLI-teknologi lyder måske skræmmende, men det er ikke svært at lære At bruge denne teknologi, man skal have adgang til et BLI-instrument og den tilhørende software.Denne video giver dig mulighed for nemt at tilpasse sig BLI-teknologien. Ca. 10 minutter før starten af en analyse, pipette 200 mikroliter af BLI buffer i en PCR rør. Fjern en nikkel NTA biosensor fra den originale emballage ved at holde den brede del af biosensoren ved hjælp af en behandsket hånd.Anbring biosensoren over PCR-røret, så kun glasspidsen på biosensoren er nedsænket i BLI-bufferen. Hold biosensorspidsen nedsænket i mindst 10 minutter for at sikre fuld hydrering. Tænd for Blitz-maskinen.Sørg for, at maskinen er tilsluttet computeren via en USB-dataudgangsport bag på maskinen. Åbn den tilhørende software på computeren, og klik på Advanced Kinetics i venstre side af skærmen. I softwaren skal du skrive alle relevante oplysninger om eksperimentet under hver af de respektive overskrifter.Klik på Biosensor Type og vælg Nickel NTA i rullemenuen. Varigheden af hvert trin kan ændres fra standard efter behov. For optimale resultater skal der anvendes mindst 30 sekunder til den oprindelige grundlinje og den oprindelige grundlinje og 120 sekunder til tilknytning og dissociation.Fjern den hydrerede NTA-biosensor fra PCR-røret, og anbring den på biosensorbehøret på maskinen ved at skubbe den brede del af biosensoren på holderen. Der anbringes et 0,5 milliliter sort mikrocentrifugerør i maskinens rørholder og pipetteres 400 mikroliter BLI-buffer i den. Luk maskinens dæksel, så biosensorspidsen nedsænkes i bufferen i mikrocentrifugerøret.Klik på Næste på softwaren for at begynde at optage den oprindelige grundlinje. Når det første grundlinjetrin er færdig med at optage, skal du åbne maskinens cover. Flyt skyderen til højre, så faldholderen er placeret foran den sorte pil.Pipette fire mikroliter af en dialyseret Hans-mærkede ligand på dropholderen og lukke dækslet af maskinen, som automatisk vil begynde at registrere lastning trin. Når indlæsningstrinnet er færdig med at registrere, skal du åbne maskinens dæksel. Flyt skyderen til venstre, således at rørholderen igen befinder sig foran den sorte pil.Luk maskinens låg, og sørg for, at biosensorspidsen nedsænkes i BLI-bufferen på røret i rørholderen. Maskinen og softwaren begynder automatisk at optage det oprindelige trin. Når det oprindelige trin er færdig med at optage, skal du åbne maskinens cover.Fjern faldholderen og rengør den ved at pipettere eventuelt protein ud og skylle det med dobbelt deioniseret vand i alt fem gange. Brug en vævsservietter til at rengøre overfladen af faldholderen efter den sidste vask. Sæt faldholderen tilbage på maskinen.Flyt skyderen på maskinen til højre, så faldholderen igen befinder sig foran den sorte pil. Pipette fire mikroliter af en dialyseret analysand på faldholderen og lukke dækslet af maskinen, som automatisk begynder at registrere foreningen trin. Når tilknytningstrinnet er færdig med at optage, skal du åbne maskinens cover.Flyt skyderen på maskinen til højre, således at rørholderen igen befinder sig foran den sorte pil, og luk maskinens dæksel, som automatisk begynder at registrere dissociationstrinnet. Når dissociationstrinnet er færdig med at optage, åbnes maskinens dæksel, og faldholderen og rørholderen fjernes. Skyl begge dele grundigt med dobbelt deioniseret vand for at vaske ethvert protein væk.Fjern biosensoren, og kassér den sikkert. Gentag disse trin for det samme ligand analysand par ved hjælp af forskellige analysand koncentrationer. Når alle kørsler er færdige, skal du gemme dataene på softwaren ved at klikke på Filer og Gem eksperiment som i venstre side af skærmen.Under overskriften Kør data skal du vælge Trinkorrektion og Tilpasning en til en og klikke på Analysér for at generere kinetiske data. Hvis du vil udtrække de kvantitative data i et regneark og generere grafer, skal du klikke på Eksporter til CSV og gemme de registrerede data som en CSV-fil. Åbn CSV-filen ved hjælp af en regnearkssoftware.Fuld længde GrgA er lavet af 288 aminosyrer. Som vist her binder en 28 aminosyre midterste region Sigma 28 direkte. Her den midterste region mærket med en ende terminal Hans-tag blev brugt som ligand, som først blev immobiliseret til spidsen af en nikkel NTA biosensor.Optagelser af forsøg med tre forskellige analysandkoncentrationer, der hver starter 30 sekunder før ligandbinding og slutter to minutter efter begyndelsen af den sidste vask, vises. Forbedret visualisering af ligandanalytforknytning og dissociation vises efter fjernelse af værdier i de første to faser og nulstilling af grundlinjen. Efter vask ubundet og terminal Hans-mærkede GrgA 138 til 165 off biosensoren, realtid forening med analysand blev registreret efter tilsætning af Sigma 28.Endelig blev realtidsspifikationen registreret efter vasken. Før BLI-analyser fjernes glycerol fra ligands og analytes. Vi anbefaler, at BLI udføres kort efter dialyse som beskrevet i teksten.Efter at have karakteriseret protein-protein interaktioner i transskription med BLI, kan man undersøge, hvordan samspillet påvirker transskription indledning, forlængelse, og eller opsigelse.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Forberedelse af Keratin hydrolysat fra kylling fjer og dens anvendelse i kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...