Name: application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (מענקים AI122034 ו AI140167) ו ניו ג'רזי קרן הבריאות (גרנט PC 20-18).

1. הכנת חלבונים
<ol><li>השתמש שקית דיאליזה (עם גודל לגזור מתאים) כדי dialyze כל חלבון לשמש ללא מוסר (כולל גם את שלו-מתויג ליגנד האנליטה) נגד 1,000 כרכים של מאגר בלי (25 מ"מ Tris-HCl, 150 mm הנאליט, 0.1 mm edta, 10 מ"מ mgcl2 , 0.1 מ"מ DTT, pH 8.0, מקורר עד 4 ° צ') ב 4 ° צ' עבור 4 h. הערה: ללא מוסר דורשים את ליגייט להיות נוכח בריכוז?...

<ol>
	<li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection.">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li><li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+sigma+factors:+a+historical,+structural,+and+genomic+perspective.">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li><li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bacterial+transcription+factors:+how+proteins+take+on+new+tasks,+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones.">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li><li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trachoma.">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections:+2008.">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li><li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children.">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li><li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse.">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li><li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry.">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li><li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia.">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li><li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li><li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li><li>Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).</li><li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation.">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li><li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+&#963;66.">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of &#963;66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li><li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+GrgA+in+regulation+of+&#963;28-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Role for GrgA in regulation of &#963;28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li><li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization.">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+(BIA).">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li><li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+(BIA/MS).">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li><li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance.">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li><li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole/glucose+oxidase+multilayers.">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li><li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions.">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li><li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors:+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications.">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects.">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li></ol>

אינטראקציות חלבונים בחלבון הן חיוניות להסדרת התמלול ולתהליכים ביולוגיים אחרים. הם למדו בדרך כלל באמצעות מוסר. למרות מוסר היורד קל יחסית לבצע, הם כמותיים גרוע ועלול להיכשל לזהות משמעות חלשה אך ביולוגית אינטראקציות. לעומת זאת, על ידי גילוי שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין ליגט לבין האנליטה, מ...

תמלול, אשר מייצרת מולקולות RNA באמצעות דנ א כתבנית, הוא השלב הראשון של ביטוי הגנים. סינתזה rna חיידקי מתחיל בעקבות איגוד של rna פולימראז (rnap) הולואנזים מיזם היעד1,2. ההאנזים RNAP (RNAPholo) מורכב הליבה קטליטי רב subunit (RNAPcore) וגורם σ, אשר נדרש לזיהוי רצף היזם. שעתוק מפעילים וrepressors, כינה באופן קולקטיבי TFs, לווסת את ביטוי הגנים באמצעות רכיבי הכריכה של RNAPcore, σ גורמים, ו/או DNA. בהתאם האורגניזם, חלק משמעותי של הגנום שלה עשוי להיות מוקדש TFs המסדירים תמלול בתגובה לצרכים פיסיולוגיים ורמזים סביבתיים3.
כלמידיה היא חיידק מחייב תאיים האחראי על מגוון מחלות בבני אדם ובעלי חיים4,5,6,7,8. לדוגמה, כלמידיה trachomatis היא ללא ספק הפתוגן מספר אחד המועבר באופן מיני בבני אדם ברחבי העולם, והגורם המוביל של עיוורון במספר מדינות לא מפותחות4,5. לכלמידיה יש מחזור התפתחותי ייחודי המאופיין בשני טפסים סלולאריים מתחלפים הנקראת הגוף היסודי (EB) והגוף הפורש (RB)9. בעוד, בס מסוגלים לשרוד בסביבה מתוך מסחטות, הם אינם מסוגלים לשגשוג. בס להזין תאים מארחים באמצעות האנדוציטוזה ולהבדיל ל-RBs גדול יותר בתוך ולבן בציטופלסמה המארח בתוך שעות שלאחר החיסון. כבר לא מדבקת, ה-RBs מתרבים באמצעות ביקוע בינארי. בסביבות 20 h, הם מתחילים להבדיל בחזרה ל-בס, אשר יוצאים מתאי המארח סביב 30-70 h.
ההתקדמות של המחזור ההתפתחותי לא מוסדר על ידי תמלול. ואילו מרבית הגנים הלא כמעט 1,000 מבוטאים במהלך מחזור האמצע שבמהלכו משכפלים את ה-RBs באופן פעיל, רק מספר קטן של גנים מועתק מיד לאחר כניסת בס לתאי המחשב המארח כדי ליזום את ההמרה של בס לתוך ה-RBs, ועוד קבוצה קטנה של גנים משועתק או יותר ויותר משועתק כדי לאפשר את הבידול של ה-RBs לתוך הבס10,11.
הגנום לא מקודד שלושה גורמים σ, כלומר σ66, σ28 ו σ54. σ66, אשר שווה ערך למשק הבית σ70 של E. coli וחיידקים אחרים, הוא אחראי לזיהוי היזמים של מוקדם באמצע מחזור גנים, כמו גם כמה גנים מאוחרים, בעוד σ28 ו σ54 נדרשים עבור שעתוק הגנים המאוחרים מסוימים. כמה גנים ידועים לשאת הן מקדם σ66התלוי ומקדם σ28התלוי.
למרות מחזור התפתחותי מסובך, רק מספר קטן של TFs נמצאו ב chlamydiae13. GrgA (בעבר מסומן כחלבון היפותטי CT504 ב c. trachomatis serovar D ו CTL0766 בתוך c. trachomatis L2 ) הוא TF כלמידיה ספציפי מזוהה בתחילה כactivator של σ66-גנים תלויים14. אהדה הנפתח בחני הוכיחו כי grga מפעיל את תמלול שלהם על ידי קשירה הן σ66 ו-DNA. מעניין, מאוחר יותר נמצא עם זה GrgA גם מדגיש עם σ28, ומפעיל תמלול מ σ28-היזמים תלויי מבחנה15. כדי לחקור אם GrgA יש האפידוקשרים דומים או שונים עבור σ66 ו-σ28, אנו נקטו להשתמש בלי. בלי לספר הראו כי GrgA אינטראקציה עם σ66 בזיקה גבוה 30-קיפול יותר מאשר עם σ28, הרומז כי grga עשוי לשחק תפקידים דיפרנציאליות σ66-תלוי שעתוק ו σ28-שעתוק תלוי . חמש עשרה
בלי מזהה את תבנית ההפרעה של אור לבן המשקף מתוך שכבה של כריכת שכבות חלבון על קצה של ביוסנסור ומשווה אותו לזה של שכבת התייחסות פנימית16. באמצעות ניתוח של שתי דפוסי הפרעה אלה, לא ניתן לספק מידע חשוב ובזמן אמת על כמות החלבון המאוגד לקצה הביוסנסור. החלבון שאינו מתואם לקצה הביו-חיישן מכונה הליגים, והוא בדרך כלל מקובל בעזרת נוגדן משותף או תג אפיפי (לדוגמה, פולי-או ביוטין-תג) שיש לו זיקה לחלקיק משויך (כגון נ. ת. ע או Streptavidin) על קצה הביוסנסור. הכריכה של חלבון משני, המכונה האנליטה, עם הליגובקצה הביוסנסור יוצרת שינויים באטימות הביוסנסור ולכן גורמת לשינויים בדפוסי ההפרעות. כאשר חוזר על ריכוזים שונים של האנליטה, בלי לספק מידע איכותי אך גם כמותי על הזיקה בין ליגל ואנליטה16.
למיטב ידיעתנו, אנחנו היינו הראשונים להעסיק בלי לאפיין את האינטראקציות חלבון חלבון בתמלול15. בפרסום זה, אנו מדגימים כי רסיס GrgA, אשר הוצגה בעבר כדי להיות נדרש עבור σ28-כריכה, אכן מדיה הכריכה. כתב היד הזה מתמקד בצעדים של "בלי הוראות", וביצירת גרפים ופרמטרים של הקינטיקה המחייבים. שיטות הייצור (וטיהור) של ליגטים ומנתחי מוצרים אינם מכוסים כאן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BLItz machine</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Ni-NTA biosensor tray</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td>Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop holder</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>CLS6571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (black)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T095100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription

שעתוק מקדם (TF) הוא חלבון המסדיר ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם RNA פולימראז, אחר TF, ו/או DNA תבנית. GrgA הוא שעתוק הרומן activator נמצא במיוחד ב כלמידיה הפתוגן בקטריאלי תאיים . חלבון מתגלה באמצעות חרוזי אהדה חשפו כי GrgA נקשר שני גורמים σ, כלומר σ66 ו σ28, אשר מזהים קבוצות שונות של היזמים עבור גנים שהמוצרים שלהם נדרשים בשלבים התפתחותיים. השתמשנו בלי לאשר ולאפיין עוד את האינטראקציות. בלי מראה מספר יתרונות על פני הנפתח: 1) הוא חושף שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין שותפי איגוד, 2) הוא מייצר פרמטרים קינטי כמותיים, ו 3) זה יכול לזהות איגודי כי לעתים קרובות נכשל לזהות. מאפיינים אלה אפשרו לנו להסיק את התפקידים הפיזיולוגיים של GrgA ברגולציה ביטוי גנטי בכלמידיה, ומנגנוני אינטראקציה מפורטים אפשריים. אנו מסוגלים לדמיין כי הטכנולוגיה הזולה יחסית יכולה להועיל מאוד ללימוד תמלול ותהליכים ביולוגיים אחרים.

באמצעות בלי לספר, הקמנו בעבר כי איגוד של GrgA ל σ28 תלוי 28 האזור האמצעי של חומצת אמינו (שאריות 138-165) של grga15. לפיכך, לעומת N-סופני שלו-מתויג באורך מלא GrgA (NH-GrgA), מחיקה GrgA לבנות חסר אזור זה (NH-GrgAΔ 138-165) היה שיעור השיוך ירד ושיעור הדיסוציאציה מוגברת, המוביל אובדן 3,000,000 מתקפל של הכולל א?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

אינטראקציה חלבון-חלבון שעתוק נחקרה באופן מסורתי באמצעות דיאליזה Por. עם זאת, דיאליזה פור הם כמותיים לחלוטין. אנו משתמשים אינטרפרומטריה קוטל ביולוגי, או BLI, כדי להתגבר על בעיה זו.בהשוואה לפור דן, BLI מזהה שיוך ודיסוציאציה בזמן אמת בין שותפי מליטה. היא גם מייצרת פרמטרים קינטיים כמותיים, המעידים על מנגנוני אינטראקציה. טכנולוגיית BLI אולי נשמעת מאיימת, אבל זה לא קשה ללמוד להשתמש בטכנולוגיה זו, אחד צריך לקבל את הגישה למכשיר BLI ואת התוכנה הקשורה.סרטון וידאו זה יאפשר לך להסתגל בקלות לטכנולוגיה של BLI. כ -10 דקות לפני תחילת בדיקה, פיפטה 200 microliters של מאגר BLI לתוך צינור PCR. הסר biosensor ניקל NTA מן האריזה המקורית על ידי החזקת החלק הרחב של biosensor באמצעות יד כפפה.מניחים את biosensor מעל צינור PCR כך שרק קצה הזכוכית של biosensor שקוע במאגר BLI. שמור על קצה biosensor שקוע לפחות 10 דקות כדי להבטיח הידרציה מלאה. תדליק את מכונת הבליץ.ודא שהמחשב מחובר למחשב באמצעות יציאת פלט נתוני USB בחלק האחורי של המחשב. במחשב, פתח את התוכנה המשויכת ולחץ על Advanced Kinetics בצד שמאל של המסך. בתוכנה, הקלד את כל המידע המתאים אודות הניסוי תחת כל כותרת בהתאמה.לחץ על סוג Biosensor ובחר ניקל NTA מהתפריט הנפתח. ניתן לשנות את משך כל שלב כברירת מחדל לפי הצורך. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במינימום של 30 שניות עבור התוכנית הבסיסית והתופעה הבסיסית ההתחלתיות ו- 120 שניות עבור שיוך ודיסוציאציה.הסר את biosensor ניקל hydrated NTA מצינור PCR ולהדביק אותו להר biosensor על המכונה על ידי החלק הרחב של biosensor על ההר. מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה שחור 0.5 מיליליטר לתוך מחזיק הצינור של המכונה ואת פיפטה 400 microliters של חיץ BLI לתוכו. סגור את המכסה של המכונה כך קצה biosensor הופך שקוע במאגר בצינור microcentrifuge.לחץ על הבא בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת התוכנית הבסיסית הראשונית. לאחר סיום ההקלטה של השלב הבסיסי הראשוני, פתח את העטיפה של המחשב. הזז את המחוון ימינה, כך שמחזיק הירידה ממוקם מול החץ השחור.פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של ליגנד מתויג שלו על מחזיק הירידה ולסגור את העטיפה של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב הטעינה. לאחר סיום שלב הטעינה, פתח את כיסוי המחשב. הזז את המחוון שמאלה, כך מחזיק הצינור ממוקם שוב מול החץ השחור.סגור את המכסה של המכונה וודא כי קצה biosensor הוא שקוע לתוך מאגר BLI של הצינור במחזיק הצינור. המחשב והתוכנה יתחילו באופן אוטומטי להקליט את השלב הבסיסי. לאחר סיום ההקלטה בשלב הבסיס, פתח את העטיפה של המחשב.הסר את מחזיק הירידה ונקה אותו על ידי צינור החוצה כל חלבון ושטיפת אותו עם מים deionized כפול במשך חמש פעמים בסך הכל. השתמש לנגב רקמה כדי לנקות את פני השטח של מחזיק טיפה לאחר לשטוף האחרון. החלף את מחזיק השחרר בחזרה למכונה.הזז את המחוון במחשב ימינה, כך שמחזיק הירידה ממוקם שוב מול החץ השחור. פיפטה ארבעה microliters של analyte דיאליזה על מחזיק טיפה ולסגור את הכיסוי של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב העמותה. לאחר ששם השיוך יסיים את ההקלטה, פתח את העטיפה של המחשב.הזז את המחוון על המכונה ימינה, כך מחזיק הצינור ממוקם שוב מול החץ השחור ולסגור את המכסה של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב הדיסוציאציה. לאחר שלב הדיסוציאציה סיים להקליט, לפתוח את הכיסוי של המכונה ולהסיר את מחזיק טיפה מחזיק צינור. שטפו היטב את שניהם במים כפולים כדי לשטוף כל חלבון.הסר את הביו-סנסור והשליך אותו בבטחה. חזור על שלבים אלה עבור אותו זוג אאנליט ליגנד באמצעות ריכוזי אנליט שונים. לאחר סיום כל הריצות, שמור את הנתונים בתוכנה על-ידי לחיצה על קובץ ושמור ניסוי בשם בצד הימני של המסך.תחת הכותרת הפעל נתונים, בחר תיקון שלבים והתאימה אחד לאחד ולחץ על נתח כדי ליצור נתונים קינטיים. כדי לחלץ את הנתונים הכמותיים לגליון עבודה וליצור גרפים, לחץ על יצא ל- CSV ושמור את הנתונים המוקלטים כקובץ CSV. פתח את קובץ ה- CSV באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני.GrgA באורך מלא עשוי 288 חומצות אמינו. כפי שמוצג כאן, 28 חומצות אמינו באזור האמצעי קושר סיגמא 28 ישירות. כאן האזור האמצעי שתויג עם מסוף קצה התג שלו שימש כליגנד, אשר היה משותק לראשונה לקצה של ניקל NTA biosensor.הקלטות של ניסויים עם שלושה ריכוזי אנליט שונים כל אחד מתחיל 30 שניות לפני קשירה ligand ומסתיים שתי דקות לאחר תחילת הכביסה האחרונה מוצגים. תצוגה חזותית משופרת של שיוך ודיסוציאציה של ליגנד אאנלייט מוצגת לאחר הסרת ערכים בשני השלבים הראשונים ואיפוס התוכנית הבסיסית. לאחר שטיפת לא מאוגד מסוף GrgA מתויג שלו 138 כדי 165 את biosensor, קשר בזמן אמת עם analyte נרשם בעקבות התוספת של סיגמא 28.לבסוף, הדיסוציאציה בזמן אמת נרשמה לאחר הכביסה. לפני בדיקת BLI, גליצרול מוסר מ ligands ו analytes. אנו ממליצים כי BLI תבוצע זמן קצר לאחר הדיאליזה כפי שנדון בטקסט.לאחר אפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בתעתיק עם BLI, ניתן לחקור כיצד האינטראקציה משפיעה על התחלת שעתוק, התארכות או סיום.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

ציפוי רשתות CryoEM בגרפן חד-שכבתי לשיפור הכנת Cryo-Sample

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

מחבר זרקור: שיפור הכנת דגימות CryoEM באמצעות גרפן monolayer על רשתות מיקרוסקופיה 

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...