Name: application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (Grants - AI122034 e AI140167) e dalla New Jersey Health Foundation (Grant - PC 20-18).

1. Preparazione delle proteine
<ol><li>Utilizzare un sacchetto di dialisi (con una dimensione di taglio appropriata) per dialisipare ogni proteina da utilizzare per i saggi BLI (compresi sia il ligando His-tagged che l'analyte) contro 1.000 volumi del buffer BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MGCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pre-raffreddato a 4 gradi centigradi) a 4 gradi centigradi per 4 h. NOTA: I saggi BLI richiedono che il ligando sia presente a concentrazioni che saturano i siti di legam...

<ol>
	<li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection.">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li><li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+sigma+factors:+a+historical,+structural,+and+genomic+perspective.">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li><li>Visweswariah, S. S., Busby, S. 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W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+(BIA/MS).">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li><li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance.">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li><li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors:+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications.">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects.">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li></ol>

Le interazioni tra proteine e proteine sono cruciali per la regolazione della trascrizione e di altri processi biologici. Sono più comunemente studiati attraverso i saggi pulldown. Anche se i saggi pulldown sono relativamente facili da eseguire, sono scarsamente quantitativi e potrebbero non riuscire a rilevare interazioni deboli ma biologicamente significative. In confronto, rilevando l'associazione e la dissociazione in tempo reale tra un ligando e un analita, BLI fornisce costanti di associazione e tasso di dissociaz...

La trascrizione, che produce molecole di RNA usando il DNA come modello, è il primo passo dell'espressione genica. La sintesi dell'RNA batterica inizia dopo il legame dell'ologassi dell'RNA polimerasi (RNAP) a un promotore bersaglio1,2. L'oloenzima RNAP (RNAPholo) è costituito da un nucleo catalitico multi-subunità (RNAPcore) e da un fattore di z, che è necessario per riconoscere la sequenza promotrice. Attivatori di trascrizione e repressori, collettivamente ritiditi TF, regolano l'espressione genica attraverso i componenti di legame dell'RNAPcore, dei fattori e/o del DNA. A seconda dell'organismo, una parte significativa del suo genoma può essere dedicata ai TF che regolano la trascrizione in risposta a i bisogni fisiologici e i segnali ambientali3.
La clamidia è un batterio intracellulare obbligato responsabile di una varietà di malattie nell'uomo e negli animali4,5,6,7,8. Ad esempio, la clamidia transatide è probabilmente il numero uno patogeno sessualmente trasmissibile negli esseri umani in tutto il mondo, e una delle principali cause di cecità in alcuni paesi sottosviluppati4,5. La clamidia ha un ciclo di sviluppo unico caratterizzato da due forme cellulari alternate definite corpo elementare (EB) e corpo reticolato (RB)9. Mentre, EBs sono in grado di sopravvivenza in un ambiente extracellulare, sono incapaci di proliferazione. Gli EB entrano nelle cellule ospiti attraverso l'endocitosi e si differenziano in MB più grandi in un vacuolo nel citoplasma ospite entro ore dopo l'inoculazione. Non più infettivi, gli MB proliferano attraverso la fissione binaria. Circa 20 h, iniziano a differenziarsi di nuovo agli EB, che escono dalle celle ospiti intorno a 30-70 h.
La progressione del ciclo di sviluppo della clamidia è regolata dalla trascrizione. Mentre una supermaggioranza dei quasi 1.000 geni clamidici è espressa durante il ciclo intermedio durante il quale gli RB si stanno replicando attivamente, solo un piccolo numero di geni viene trascritto immediatamente dopo l'ingresso di EB nelle cellule ospiti per avviare la conversione di Gli EB in MB e un altro piccolo insieme di geni sono trascritti o sempre più trascritti per consentire la differenziazione degli MB in EB10,11.
Il genoma clamidiale codifica tre fattori, vale a dire66,28 e54. 66, che è equivalente alla pulizia di 70 e altri batteri, è responsabile del riconoscimento dei promotori di geni precoci e a metà ciclo, nonché di alcuni geni in ritardo, mentre sono necessari28 e 54 la trascrizione di alcuni geni tardivi. Sono noti che diversi geni trasportano sia un promotore dipendente da66usd che un promotore dipendente da28USD 12.
Nonostante un ciclo di sviluppo complicato, solo un piccolo numero di TF sono stati trovati in clamidiae13. GrgA (precedentemente annotato come una proteina ipotetica CT504 in C. trachomatis serovar D e CTL0766 in C. trachomatis L2) è un TF specifico di Chlamydiainizialmente riconosciuto come un attivatore di geni dipendenti da66. I saggi di tracciamento dell'affinità hanno dimostrato che GrgA attiva la loro trascrizione legando sia il DNA di66 che quello del DNA. È interessante notare che, in seguito è stato trovato con che GrgA co-precipita anche con28, e attiva la trascrizione da28-dipendentipromotori in vitro15. Per verificare se GrgA ha affinità simili o diverse per i valori66 e28, abbiamo fatto ricorso all'utilizzo di BLI. I saggi BLI hanno dimostrato che il GrgA interagisce con 66 volte con un'affinità 30 volte superiore rispetto a quella di28, suggerendo che GrgA può svolgere ruoli differenziali nella trascrizione dipendente da66USD e nella trascrizione dipendente da28 15.
BLI rileva il modello di interferenza della luce bianca che si riflette da uno strato di proteine immobilizzate sulla punta di un biosensore e lo confronta con quello di un livello di riferimento interno16. Attraverso l'analisi di questi due modelli di interferenza, BLI può fornire informazioni preziose e in tempo reale sulla quantità di proteine legate alla punta del biosensore. La proteina che viene immobilizzata sulla punta del biosensore è chiamata ligando, ed è generalmente immobilizzata con l'aiuto di un anticorpo comune o di un tag epitopo (ad esempio, un poli-His- o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un Streptavidin) sulla punta del biosensore. Il legame di una proteina secondaria, indicato come analita, con il ligando sulla punta del biosensore crea cambiamenti nell'opacità del biosensore e quindi si traduce in cambiamenti nei modelli di interferenza. Quando si ripete su diverse concentrazioni dell'analita, BLI può fornire non solo informazioni qualitative ma anche quantitative sull'affinità tra il ligando e l'analita16.
Per quanto ne sappiamo, siamo stati i primi ad impiegare BLI per caratterizzare le interazioni proteina-proteina nella trascrizione15. In questa pubblicazione, dimostriamo che un frammento di GrgA, che in precedenza è stato dimostrato essere necessario per l'associazione28,media effettivamente l'associazione. Questo manoscritto si concentra sui passi dei saggi BLI e sulla generazione di grafici BLI e parametri di cinetica legante. I metodi per la produzione (e la purificazione) di ligandi e analiti non sono coperti qui.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BLItz machine</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Ni-NTA biosensor tray</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td>Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop holder</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>CLS6571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (black)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T095100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription

Un fattore di trascrizione (TF) è una proteina che regola l'espressione genica interagendo con la polimerasi dell'RNA, un altro TF e/o il DNA del modello. GrgA è un nuovo attivatore di trascrizione trovato specificamente nel patogeno batterico intracellulare obbligatorio Chlamydia. L'abbattimenti delle proteine che utilizzano perline di affinità hanno rivelato che laGrgA lega due fattori, vale a dire ilvalore di 66 , che riconoscono diversi gruppi di promotori per i geni i cui prodotti sono necessari in modo differenziale nelle fasi di sviluppo. Abbiamo usato BLI per confermare e caratterizzare ulteriormente le interazioni. BLI dimostra diversi vantaggi rispetto al pulldown: 1) Rivela l'associazione in tempo reale e la dissociazione tra i partner di legame, 2) Genera parametri cinetici quantitativi, e 3) Può rilevare attacchi che i saggi pulldown spesso non riescono a rilevare. Queste caratteristiche ci hanno permesso di dedurre i ruoli fisiologici di GrgA nella regolazione dell'espressione genica in Chlamydiae possibili meccanismi di interazione dettagliati. Prevediamo che questa tecnologia relativamente conveniente può essere estremamente utile per studiare la trascrizione e altri processi biologici.

Attraverso i test BLI, in precedenza abbiamo stabilito che il legame di GrgA a28 è dipendente da una regione media di 28 amminoacidi (residui 138-165) di GrgA15. Di conseguenza, rispetto a GrgA (NH-GrgA) a lunghezza piena etichettati con N-terminale, un costrutto di delezione GrgA privo di questa regione (NH-GrgA-138-165) ha registrato una diminuzione del tasso di associazione e un aumento del tasso di dissociazione, che ha portato a una perdita complessiva di 3 milioni di affinità (<...

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Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Le interazioni dei fattori di trascrizione (TF) con la polimerasi dell'RNA sono di solito studiate utilizzando saggi pulldown. Applichiamo una tecnologia di interferometria biostrato (BLI) per caratterizzare l'interazione di GrgA con la mistidiaRNA polimerasi. Rispetto ai test pulldown, BLI rileva l'associazione e la dissociazione in tempo reale, offre una maggiore sensibilità ed è altamente quantitativa.

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

L'interazione proteina-proteina nella trascrizione è stata tradizionalmente studiata usando la dialisi del Por. Tuttavia, la por dialisi è puramente quantitativa. Usiamo l'interferometria del biostrato, o BLI, per superare questo problema.Rispetto a Por dan, BLI rileva l'associazione e la dissociazione in tempo reale tra i partner di legame. Genera anche parametri cinetici quantitativi, che sono indicativi dei meccanismi di interazione. La tecnologia BLI può sembrare intimidatoria, ma non è difficile imparare A utilizzare questa tecnologia, è necessario avere l'accesso a uno strumento BLI e al software associato.Questo video ti permetterà di adattarti facilmente alla tecnologia BLI. Circa 10 minuti prima dell'inizio di un test, pipettare 200 microlitri del tampone BLI in un tubo PCR. Rimuovere un biosensore in nichel NTA dalla confezione originale tenendo l'ampia porzione del biosensore utilizzando una mano guantata.Posizionare il biosensore sul tubo PCR in modo che solo la punta di vetro del biosensore sia immersa nel buffer BLI. Mantenere la punta del biosensore sommersa per almeno 10 minuti per garantire la piena idratazione. Accendi la macchina Blitz.Assicurarsi che la macchina sia collegata al computer tramite una porta di uscita dati USB sul retro della macchina. Sul computer, aprire il software associato e fare clic su Cinetica avanzata sul lato sinistro dello schermo. Nel software, digitare tutte le informazioni appropriate sull'esperimento sotto ogni rispettiva voce.Fate clic su Tipo biosensore (Biosensor Type) e scegliete Nickel NTA dal menu a discesa. La durata di ogni passaggio può essere modificata rispetto all'impostazione predefinita in base alle esigenze. Per risultati ottimali utilizzare almeno 30 secondi per la linea di base iniziale e la linea di base e 120 secondi per l'associazione e la dissociazione.Rimuovere il biosensore idratato in nichel NTA dal tubo PCR e apporrlo sul supporto del biosensore sulla macchina facendo scorrere l'ampia porzione del biosensore sul supporto. Inserire un tubo di microcentrifugo nero da 0,5 millilitri nel supporto del tubo della macchina e pipettare 400 microlitri di tampone BLI. Chiudere il coperchio della macchina in modo che la punta del biosensore diventi sommersa nel tampone nel tubo di microcentrifugo.Fare clic su Avanti sul software per iniziare a registrare la linea di base iniziale. Al termine della registrazione del passaggio di base iniziale, aprire il coperchio della macchina. Spostare il dispositivo di scorrimento verso destra, in modo che il portaoccioline si trova di fronte alla freccia nera.Pipettare quattro microlitri di un ligando dializzato is-taggato sul portaocciolo e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di caricamento. Al termine della registrazione della fase di caricamento, aprire il coperchio della macchina. Spostare il dispositivo di scorrimento a sinistra, in modo che il supporto del tubo sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera.Chiudere il coperchio della macchina e assicurarsi che la punta del biosensore sia immersa nel tampone BLI del tubo nel supporto del tubo. La macchina e il software inizieranno automaticamente a registrare il passaggio di base. Al termine della registrazione del passaggio di base, aprire il coperchio della macchina.Rimuovere il portagocciola e pulirlo pipettando qualsiasi proteina e risciacquarla con acqua doppia deionizzata per un totale di cinque volte. Utilizzare una salvietta tissutale per pulire la superficie del portaocciole dopo l'ultimo lavaggio. Sostituire di nuovo il portaocciolo sulla macchina.Spostare il cursore sulla macchina a destra, in modo che il portaoccioline sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera. Pipettare quattro microlitri di un alita dializzato sul portapenne e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di associazione. Al termine della registrazione della fase di associazione, aprire il coperchio della macchina.Spostare il cursore sulla macchina a destra, in modo che il supporto del tubo sia ancora una volta situato di fronte alla freccia nera e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare il passaggio di dissociazione. Al termine della registrazione della fase di dissociazione, aprire il coperchio della macchina e rimuovere il portagoccioline e il supporto del tubo. Risciacquare accuratamente entrambi con acqua doppia deionizzata per lavare via qualsiasi proteina.Rimuovere il biosensore e scartarlo in modo sicuro. Ripetere questi passaggi per la stessa coppia di aliti ligandi utilizzando diverse concentrazioni di aliti. Una volta terminate tutte le esecuzioni, salvare i dati sul software facendo clic su File e Salva esperimento con nome sul lato sinistro dello schermo.Nell'intestazione Esegui dati selezionare Correzione passo e Raccordo uno a uno e fare clic su Analizza per generare dati cinetici. Per estrarre i dati quantitativi in un foglio di lavoro e generare grafici, fare clic su Esporta in CSV e salvare i dati registrati come file CSV. Aprire il file CSV utilizzando un software per fogli di calcolo.GrgA a figura intera è composto da 288 amminoacidi. Come mostrato qui, una regione media di 28 amminoacidi lega direttamente Sigma 28. Qui la regione centrale contrassegnata con un terminale finale His-tag è stato usato come ligando, che è stato prima immobilizzato sulla punta di un biosensore di nichel NTA.Vengono mostrate registrazioni di esperimenti con tre diverse concentrazioni di aliti ciascuna che iniziano 30 secondi prima del legame del ligando e terminano due minuti dopo l'inizio dell'ultimo lavaggio. Una migliore visualizzazione dell'associazione e della dissociazione degli aliti ligandi è mostrata dopo la rimozione dei valori nelle prime due fasi e il ripristino della linea di base. Dopo aver lavato il GrgA 138-165 non legato e terminale dal biosensore, l'associazione in tempo reale con l'alyte è stata registrata in seguito all'aggiunta di Sigma 28.Infine, la dissociazione in tempo reale è stata registrata dopo il lavaggio. Prima che il BLI dica, il glicerolo viene rimosso da ligandi e aaliti. Si consiglia di eseguire BLI subito dopo la dialisi, come discusso nel testo.Dopo aver caratterizzato le interazioni proteina-proteina nella trascrizione con la BLI, si può indagare come l'interazione influenzi l'iniziazione della trascrizione, l'allungamento e o la terminazione.

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Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

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Biochimica

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