Name: application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrag # AI122034 och AI140167) och New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).

1. beredning av proteiner
<ol><li>Använd en dialys påse (med lämplig cut-off-storlek) för att dialysera varje protein som ska användas för BLI-analyser (inklusive både den hans-märkta ligand och analyten) mot 1 000 volymer av BLI-bufferten (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, förkyld till 4 ° c) vid 4 ° c i 4 h. Anmärkning: BLI-analyser kräver att ligand är närvarande vid koncentrationer som mättat de bindningsställen på biosensorn och analyten som...

<ol>
	<li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection.">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li><li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+sigma+factors:+a+historical,+structural,+and+genomic+perspective.">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li><li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bacterial+transcription+factors:+how+proteins+take+on+new+tasks,+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones.">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li><li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trachoma.">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections:+2008.">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li><li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children.">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li><li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse.">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li><li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry.">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li><li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia.">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li><li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li><li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis.">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li><li>Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).</li><li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation.">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li><li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+&#963;66.">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of &#963;66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li><li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+GrgA+in+regulation+of+&#963;28-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Role for GrgA in regulation of &#963;28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li><li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization.">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+(BIA).">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li><li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+(BIA/MS).">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li><li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance.">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li><li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole/glucose+oxidase+multilayers.">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li><li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions.">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li><li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors:+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications.">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects.">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li></ol>

Protein-proteininteraktioner är avgörande för regleringen av transkription och andra biologiska processer. De är vanligast studeras genom PULLDOWN analyser. Även PULLDOWN analyser är relativt lätt att utföra, de är dåligt kvantitativa och kan misslyckas med att upptäcka svaga men biologiskt meningsfulla interaktioner. I jämförelse, genom att upptäcka realtid Association och dissociation mellan en ligand och en analyt, ger BLI Association och dissociation Rate konstanter, samt, övergripande tillhörighet.</...

Transkription, som producerar RNA-molekyler som använder DNA som mall, är det första steget i genuttrycket. Bakteriell RNA-syntes börjar efter bindningen av RNA-polymeras (rnap) holoenzym till en mål promotor1,2. Den RNAP holoenzym (RNAPholo) består av en multi-subunit katalytisk kärna (RNAPcore) och en σ Factor, som krävs för att erkänna promotorn sekvensen. Transkription aktivatorer och repressorer, kollektivt kallas TFs, reglera genuttrycket genom de bindande komponenterna i RNAPcore, σ faktorer, och/eller DNA. Beroende på organismen kan en betydande del av arvsmassan ägnas åt TFs som reglerar transkription som svar på fysiologiska behov och Miljösignaler3.
Klamydia är en obligate intracellulär bakterie som ansvarar för en mängd olika sjukdomar hos människor och djur4,5,6,7,8. Till exempel är Chlamydia trachomatis utan tvekan den främsta sexuellt överförbara patogenen i människor över hela världen, och en ledande orsak till blindhet i vissa underutvecklade länder4,5. Klamydia har en unik utvecklingscykel som kännetecknas av två omväxlande cellulära former kallas den elementära kroppen (EB) och nätaktigt Body (RB)9. Medan EBs kan överleva i en extracellulär miljö, de är oförmögna att spridning. EBS ange värdceller genom endocytos och differentiera till större RBS i en vakuol i värdens cytoplasma inom några timmar efter inympning. Inte längre infektiösa, RBS föröka sig genom binär fission. Runt 20 h, börjar de att differentiera tillbaka till EBs, som lämnar värdcellerna runt 30-70 h.
Progression av klamydia utvecklingscykeln regleras genom transkription. En supermajoritet av de nästan 1 000 klamydial generna uttrycks under den midcycle under vilken RBs aktivt replikerar, men endast ett litet antal gener transkriberas omedelbart efter det att EBs har inträtt i värdcellerna för att initiera omvandlingen av EBs till RBs, och en annan liten uppsättning gener transkriberas eller alltmer transkriberas för att möjliggöra differentiering av RBs i EBs10,11.
Klamydia arvsmassan kodar för tre σ-faktorer, nämligen σ66, σ28 och σ54. σ66, som motsvarar den städ-σ70 av E. coli och andra bakterier, är ansvarig för att erkänna initiativtagarna till tidiga och medelcyklande gener samt vissa sena gener, medan σ28 och σ54 krävs för transkription av vissa sena gener. Flera gener är kända för att bära både en σ66-beroende promotor och en σ28-beroende promotor12.
Trots en komplicerad utvecklingscykel har endast ett litet antal TFs hittats i Chlamydiae13. GrgA (tidigare kommenterade som ett hypotetiskt protein CT504 i c. trachomatis serovar D och CTL0766 i c. trachomatis L2) är en KLAMYDIA-specifik TF initialt erkänd som en aktivare av σ66-beroende gener14. Affinitet PULLDOWN-analyser har visat att GrgA aktiverar sin transkription genom att binda både σ66 och DNA. Intressant, det var senare hittades med att GrgA också Co-fällates med σ28, och aktiverar transkription från σ28-beroende initiativtagare in vitro-15. För att undersöka om GrgA har liknande eller olika tillhörighet för σ66 och σ28så använder vi bli. BLI-analyser har visat att GrgA interagerar med σ66 vid en 30-faldig högre affinitet än med σ28, vilket tyder på att Grga kan spela differential roller i σ66-beroende transkription och σ28-beroende transkription 15.
BLI upptäcker interferensmönstret av vitt ljus som reflekterar från ett skikt av immobiliserat protein på spetsen av en biosensor och jämför det med en intern referensskikt16. Genom analysen av dessa två störnings mönster, kan BLI ge värdefull och realtidsinformation om mängden proteinbundet till spetsen av biosensorn. Proteinet den där er immobiliserade till spets om bio sensoren är benämn så den ligand, och är vanligvis immobiliserade med det hjälp av en gemensam kropp eller epitop tag (e.g., en poly-hans-eller biotin-tag) så pass har en affinitet för en förbundet partikel (sådan som nta eller Streptavidin) på spetsen av biosensorn. Bindningen av ett sekundärt protein, kallad analyten, med ligand vid spetsen av biosensorn skapar förändringar i bio sensorns opacitet och leder därför till förändringar i störnings mönstren. Vid upprepad över olika koncentrationer av analyten kan BLI ge inte bara kvalitativ utan även kvantitativ information om affinitet mellan ligand och analyt16.
Till det bästa av vår kunskap var vi de första att anställa BLI att karakterisera protein-protein interaktioner i transkription15. I den här publikationen visar vi att ett GrgA-fragment, som tidigare visats vara obligatoriskt för σ28-bindande, faktiskt förmedlar bindningen. Detta manuskript fokuserar på steg i BLI-analyser och generering av BLI grafer och parametrar för bindningskinetik. Metoder för produktion (och rening) av ligander och analyter täcks inte här.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BLItz machine</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Ni-NTA biosensor tray</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td>Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop holder</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>CLS6571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (black)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T095100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription

En transkriptionsfaktor (TF) är ett protein som reglerar genuttryck genom att interagera med RNA-polymeras, en annan TF, och/eller mall-DNA. GrgA är en roman transkription Activator finns specifikt i obligate intracellulära bakteriella patogenen klamydia. Protein PULLDOWN-analyser med affinitet pärlor har avslöjat att GrgA binder två σ-faktorer, nämligen σ66 och σ28, som erkänner olika uppsättningar av promotorer för gener vars produkter differentially krävs i utvecklingsstadier. Vi har använt BLI för att bekräfta och ytterligare karakterisera samspelet. BLI visar flera fördelar jämfört med PULLDOWN: 1) det avslöjar realtid Association och dissociation mellan bindande partners, 2) Det genererar kvantitativa kinetiska parametrar, och 3) det kan upptäcka bindningar som PULLDOWN analyser ofta misslyckas med att upptäcka. Dessa egenskaper har gjort det möjligt för oss att härleda de fysiologiska rollerna för GrgA i gen uttrycks reglering i klamydia, och eventuella detaljerade interaktionsmekanismer. Vi ser att denna relativt överkomliga teknik kan vara mycket användbar för att studera transkription och andra biologiska processer.

Genom BLI assays har vi tidigare fastställt att bindning av GrgA till σ28 är beroende av en 28 Amino Acid mellersta region (rester 138-165) av Grga15. Följaktligen, jämfört med N-terminally hans-märkta full längd GrgA (NH-GrgA), en GrgA radering konstruera saknar denna region (NH-GrgAΔ 138-165) hade en minskad associerings takt och en ökad dissociation takt, vilket leder till en 3 000 000-faldig förlust av totala affinitet (tabell 1). Här visar vi att denna ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription at JoVE.com

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interaktioner av transkriptionsfaktorer (TFs) med RNA-polymeras studeras vanligtvis med PULLDOWN-analyser. Vi tillämpar en teknik för Biolayer interferometri (BLI) för att karakterisera interaktionen mellan GrgA och klamydial RNA-polymeras. Jämfört med PULLDOWN-analyser upptäcker BLI realtids Association och dissociation, ger högre känslighet och är mycket kvantitativ.

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Protein-protein interaktion i transkription har traditionellt studerats med hjälp av Por dialys. Emellertid, Por dialys är rent kvantitativa. Vi använder biolagerinterferometri, eller BLI, för att övervinna detta problem.Jämfört med Por dan, KÄNNER BLI av realtidsassociering och dissociation mellan bondingpartner. Det genererar också kvantitativa kinetiska parametrar, som är vägledande för interaktionsmekanismer. BLI-tekniken kan låta skrämmande, men det är inte svårt att lära sig Att använda denna teknik, måste man ha tillgång till ett BLI-instrument och tillhörande programvara.Denna video gör det möjligt för dig att enkelt anpassa sig till BLI-tekniken. Cirka 10 minuter före starten av en analys, pipetter 200 mikroliter av BLI bufferten i ett PCR-rör. Ta bort en nickel NTA-biosensor från originalförpackningen genom att hålla den breda delen av biosensorn med hjälp av en handske.Placera biosensorn över PCR-röret så att endast glasspetsen på biosensorn är nedsänkt i BLI-bufferten. Håll biosensorspetsen nedsänkt i minst 10 minuter för att säkerställa full hydrering. Slå på Blitz-maskinen.Se till att maskinen är ansluten till datorn genom en USB-datautgångsport på baksidan av maskinen. På datorn, öppna tillhörande programvara och klicka på Avancerad Kinetics på vänster sida av skärmen. I programvaran skriver du ut all lämplig information om experimentet under respektive rubrik.Klicka på Biosensor Typ och välj Nickel NTA från dropdown menyn. Varaktigheten för varje steg kan ändras från standard efter behov. För optimala resultat använd minst 30 sekunder för initial baslinje och baslinje och 120 sekunder för association och dissociation.Ta ut den hydrerade nickel NTA-biosensorn från PCR-röret och fäst den på biosensorfästet på maskinen genom att skjuta den breda delen av biosensorn på fästet. Placera ett 0,5 milliliter svart mikrocentrifugrör i maskinens rörhållare och pipetter 400 mikroliter av BLI-buffert i den. Stäng luckan till maskinen så att biosensorspetsen blir nedsänkt i bufferten i mikrocentrifugröret.Klicka på Nästa på programvaran för att börja spela in den inledande baslinjen. När det inledande baslinjesteget har spelat klart, öppna maskinens lock. Flytta reglaget åt höger, så att dropphållaren är placerad framför den svarta pilen.Pipette fyra mikroliter av en dialyzed His-taggade ligand på dropphållaren och stänga locket på maskinen, som automatiskt kommer att börja registrera lastning steg. Efter att laststeget har spelat klart, öppna luckan till maskinen. Flytta reglaget åt vänster, så att rörhållaren återigen är placerad framför den svarta pilen.Stäng locket på maskinen och se till att biosensorspetsen är nedsänkt i BLI-bufferten för röret i rörhållaren. Maskinen och programvaran kommer automatiskt att börja registrera baslinjesteget. När baslinjesteget har spelat klart öppnar du luckan till maskinen.Ta bort dropphållaren och rengör den genom att pipettera ut eventuellt protein och skölja den med dubbelt avjoniserat vatten i totalt fem gånger. Använd en vävnadstorka för att rengöra ytan på dropphållaren efter den sista tvätten. Sätt tillbaka släpphållaren på maskinen igen.Flytta reglaget på maskinen till höger, så att dropphållaren återigen är placerad framför den svarta pilen. Pipett fyra mikroliter av en dialyserad analyt på dropphållaren och stäng locket på maskinen, som automatiskt kommer att börja spela in föreningen steg. Efter att föreningssteget har spelat klart öppnar du luckan till maskinen.Flytta reglaget på maskinen till höger, så att rörhållaren återigen är placerad framför den svarta pilen och stäng luckan till maskinen, som automatiskt kommer att börja registrera dissociationssteget. När dissociationssteget har spelat klart öppnar du luckan på maskinen och tar bort dropphållaren och rörhållaren. Skölj noggrant båda med dubbelt avjoniserat vatten för att tvätta bort eventuellt protein.Ta bort biosensorn och kassera den på ett säkert sätt. Upprepa dessa steg för samma ligand analyte par med hjälp av olika analyt koncentrationer. När alla körningar har avslutats sparar du data på programvaran genom att klicka på Arkiv och Spara experiment som till vänster på skärmen.Under rubriken Kör data väljer du Stegkorrigering och montering av en till en och klickar på Analysera för att generera kinetisk data. För att extrahera de kvantitativa uppgifterna i ett kalkylblad och generera grafer, klicka på Exportera till CSV och spara de inspelade uppgifterna som en CSV-fil. Öppna CSV-filen med hjälp av ett kalkylprogram.Full längd GrgA är tillverkad av 288 aminosyror. Som visas här, en 28 aminosyra mellersta regionen binder Sigma 28 direkt. Här den mellersta regionen taggade med en slutterminal His-tag användes som liganden, som först immobiliserades till spetsen av en nickel NTA biosensor.Inspelningar av experiment med tre olika analytkoncentrationer vardera med början 30 sekunder före ligandbindningen och slutar två minuter efter början av den sista tvätten visas. Förbättrad visualisering av ligand analyt association och dissociation visas efter borttagning av värden i de två första stadierna och återställning av baslinjen. Efter tvätt obundet och terminal His-taggade GrgA 138 till 165 av biosensor, realtidsassociation med analyten spelades in efter tillägg av Sigma 28.Slutligen spelades den reala tidsdesociationen in efter tvätten. Innan BLI-analyser avlägsnas glycerol från ligander och analyter. Vi rekommenderar att BLI utförs snart efter dialys som diskuteras i texten.Efter att ha karakteriserat protein-protein interaktioner i transkription med BLI, kan man undersöka hur interaktionen påverkar transkription initiering, töjning, och eller uppsägning.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Unit 1

Energy and Catalysis

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysera dynamiska proteinkomplex monterat på och släppt från Biolayer interferometri Biosensor med hjälp av masspektrometri och elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-analys i kombination med samuttryck i bakterieceller som ett tidseffektivt verktyg för att testa utmanande protein-proteininteraktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Beläggning av CryoEM-rutnät med monolagergrafen för att förbättra förberedelsen av kryoprover

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Författare i fokus: Förbättra CryoEM-provberedning med hjälp av grafenmonolager på mikroskopigaller 

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...