Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

تلقت TT منحة KAKENHI JSPS (JP16H06532، JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, و JP15K00413) من MEXT والمنح من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] وH30 [18062156]). نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة توكوشيما بونري. البروتوكول التالي لإعداد شريحة هو تقريبا إجراء قياسي27 ، ولكن التعديلات كانت بروتوكولات تلطيخ وتسجيل مع VSD.
1. التحضير قبل يوم التجر?...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

الفسيولوجيا شريحة أمر حيوي لجمع الإشارة الصحيحة. استخدام نظام تصفية غشاء حلقة في هذا البروتوكول يضمن أن شريحة لا تزال صحية وغير مشوهة في جميع أنحاء الإجراء2,16,17. يمكن استخدام أنظمة أخرى للاحتفاظ بشريحة وظائف الأعضاء أثناء التسجيل، ولكن ي?...

وقد أصبح واسعة المجال واحد الفوتون الحساسة للفولطية الحساسة (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ الملطخة بالجملة أداة كمية مفيدة لتقييم ديناميات الدوائر العصبية1،2،3،4 . بعد تحليل التغيرات في الخصائص البصرية بسبب الإثارة الغشاء5,6,7, تم وصف التصوير VSD لأول مرة في أوائل 1970s من قبل كوهين وآخرون6,8, 9. وهو طريقة مناسبة لمراقبة وظائف الدماغ في الوقت الحقيقي كما الصبغة تحقيقات مباشرة التغيرات المحتملة غشاء (أي، إشارة أساسية من الخلايا العصبية).
يمتلك أقرب VSDs الخصائص المرغوبة لفهم نظام الدماغ، مثل سريع الوقت ثابت لمتابعة الحركية السريعة للأحداث المحتملة غشاء الخلايا العصبية، والخطي مع التغير في الغشاء المحتملة9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. على غرار تجارب التصوير الأخرى، تتطلب هذه التقنية مجموعة واسعة من التوليفات المحددة، مثل الكاميرات والبصريات والبرمجيات وعلم وظائف الأعضاء، لتحقيق النتائج المرجوة. وبسبب هذه المزالق التقنية، لم تتحقق بالضرورة الفوائد المتوقعة خلال الجهود الأولية بالنسبة لمعظم المختبرات التي لم تكن متخصصة في هذه التقنية.
كان السبب الأولية للصعوبة التقنية ضعف حساسية VSD تجاه التغير المحتمل للغشاء عند تطبيقه على تلطيخ الجزء الأكبر من الاستعدادات شريحة. حجم الإشارة البصرية (أي التغير الكسري في الفلورية) عادة مايكون 10-4 -10-3 من إشارة التحكم (F0) تحت الظروف الفسيولوجية. المقياس الزمني للتغير المحتمل في الغشاء في الخلايا العصبية هو ما يقرب من ميلي ثانية إلى بضع مئات من مللي ثانية. لقياس التغيرات في التغيرات في الغشاء المحتمل للخلايا العصبية، يجب أن تكون الكاميرا المستخدمة للتسجيل قادرة على الحصول على صور بسرعة عالية (10 كيلو هرتز إلى 100 هرتز). تتطلب الحساسية المنخفضة لـ VSD والسرعة اللازمة لمتابعة الإشارة العصبية كمية كبيرة من الضوء ليتم جمعها في الكاميرا بسرعة عالية، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (S/N)2،16.
كما أن بصريات نظام التسجيل عنصر حاسم لضمان جمع الضوء الكافي وتحسين S/N. التكبير الذي تحققه البصريات غالبا ما يكون منخفضا بشكل مفرط، مثل 1X إلى 10X، لتصور الدائرة العصبية الوظيفية المحلية. على سبيل المثال، لتصور ديناميات الدائرة الحصين، فإن التكبير من حوالي 5 سيكون مناسبا. مثل هذا التكبير منخفضة منخفضة الكفاءة الفلورسنت; لذلك، فإن البصريات المتقدمة تكون مفيدة لمثل هذا التسجيل.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفسيولوجيا شريحة ضرورية أيضا. وبما أن تحليل التصوير يتطلب أن تكون الشرائح سليمة، فإن هناك حاجة إلى التعامل مع شريحة دقيقة17. وعلاوة على ذلك، فإن التدابير المتخذة للحفاظ على صلاحية الشريحة لفترة أطول هي18.
تصف هذه المقالة بروتوكول إعداد الشرائح، تلطيخ VSD، والقياسات. كما توضح المقالة التحسينات التي أدخلت على VSDs وجهاز التصوير والبصريات، وغيرها من التحسينات الإضافية للنظام التجريبي التي مكنت من استخدام هذه الطريقة كاختبار مباشر وقوي وكمي لتصور تعديل وظائف الدماغ19,20,21,22,23,24,25. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للتقوية على المدى الطويل في منطقة CA1 من شرائح الحصين1. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية هي أيضا مفيدة في التسجيل البصري لإمكانات الغشاء في خلية عصبية واحدة26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

واسعة المجال واحد الفوتون الجهد الحساسة صبغ (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ هو أداة مفيدة لتقييم الاتصال الوظيفي في الدوائر العصبية. بسبب التغير الجزئي في إشارة الضوء، كان من الصعب استخدام هذه الطريقة كتحليل كمي. توضح هذه المقالة البصريات الخاصة وأنظمة معالجة الشرائح، مما يجعل هذه التقنية مستقرة وموثوق بها. توضح هذه المقالة التعامل مع شريحة، تلطيخ، وتسجيل شرائح الحصين الملطخة VSD بالتفصيل. يحافظ النظام على الظروف الفسيولوجية لفترة طويلة، مع تلطيخ جيد، ويمنع الحركات الميكانيكية للشريحة أثناء التسجيلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تلطيخ شرائح مع كمية صغيرة من الصبغة. تحقق البصريات فتحة رقمية عالية عند التكبير المنخفض، مما يسمح بتسجيل إشارة VSD بمعدل إطار أقصى قدره 10 كيلو هرتز، مع دقة مكانية 100 بكسل × 100 بكسل. ونظرا لارتفاع معدل الإطار والدقة المكانية، تسمح هذه التقنية بتطبيق مرشحات ما بعد التسجيل التي توفر نسبة كافية من الإشارة إلى الضوضاء لتقييم التغيرات في الدوائر العصبية.

ويبين الشكل 5 الإشارة البصرية التمثيلية عند التحفيز الكهربائي لضمانات شافر في المنطقة CA1 لشريحة فرس النهر. الصور المتتالية في الشكل 5A تظهر الإشارة البصرية قبل تطبيق أي مرشحات مكانية وزمنية، في حين يظهر الشكل 5B نفس البيانا?...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

نحن نقدم طريقة تسجيل بصري قابل للتكرار ومستقرة لشرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد. تصف المقالة تلطيخ الصبغة الحساسة للجهد الكهربائي وتسجيل الإشارات البصرية باستخدام الاستعدادات التقليدية لشريحة الحصين.

تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

ويعتقد أن طريقة التسجيل البصري مع صبغة حساسة الجهد لتكون التكنولوجيا المثالية لتصور كيف يعمل الدماغ. هذه الطريقة سمحت لنا لتسجيل ديناميات العصبية النفسية بشكل مستقر وموثوق به أكثر من 12 ساعة، نظرا لنا وجهة نظر على النشاط النفسي. نحن نحاول توسيع نطاق التطبيق للكشف عن التغيرات الدائرة الناجمة عن المواد الكيميائية على جميع مراحل التنمية، مثل تطبيق حمض قيمة للأمهات.هذه التقنية راسخة بالفعل. يرجى محاولة إعادة إنتاج الدراسات باتباع الطريقة المعروضة هنا. لبدء هذا الإجراء، غمر الرأس مقطوعة الرأس في الجليد البارد ACSF في علبة جراحية الفولاذ المقاوم للصدأ.استخراج الدماغ في غضون دقيقة واحدة ووضعها في منقار يحتوي على ACSF المبردة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتقسيم قسم الدماغ في خط الوسط بمشرط ووضع كلا نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار بنسبة 4٪. ثم، ضع كتلة الدماغ مع كل نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار 4٪.امسح ACSF الزائد من الكتلة بورقة تصفية. في وقت لاحق، وتطبيق superglue على منصة هزاز. ضع كتلة agar عليها وامسح لاصقة المفرطة مع ورقة مرشح.تطبيق بلطف كمية صغيرة من الجليد البارد ACSF من الجزء العلوي من كتلة أجار الدماغ للمساعدة في ترسيخ superglue الزائدة ومنع الغراء من تغطية الدماغ وإزعاج تشريح. بعد ذلك، قم بإصلاح المنصة إلى صينية الاهتزاز وصب ACSF المعدلة. تعيين هزاز إلى سرعة بطيئة ويكون تردد شفرة في الإعداد الأقصى.ثم ابدأ في التقطيع. ضع الشرائح في زاوية غرفة الشريحة بالتسلسل بحيث يمكن تمييز ترتيب الشرائح بسهولة. وعادة ما يمكن الحصول على ثلاث إلى خمس شرائح من نصف الكرة الأرضية واحد.بعد ذلك، قطع جزء جذع الدماغ باستخدام إبرة قياس 30. باستخدام فرشاة طلاء صغيرة، ضع الشريحة على مرشح الغشاء الذي يحمله خاتم زجاج شبكي. ضع الخاتم في غرفة استرداد رطبة واضمن الغطاء للحفاظ على الضغط الداخلي مرتفعًا.عند وضع الشريحة على مرشح الغشاء، ضبط اتجاه وموقف شريحة داخل حلقة لضمان أن يكون مركزها بشكل جيد ولها اتجاه ثابت. اترك العينة عند درجة 28 مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة على الأقل للتعافي. لطخة الشرائح، وتطبيق بلطف 100 ميكرولترات من حل تلطيخ على كل شريحة واحتضان في 20 دقيقة لدرجة حرارة الغرفة.المقبل، وإعداد 50 إلى 100 ملليلتر من ACSF في حاوية. ضع الخاتم مع العينة فيه لشطف محلول التلطخ. ثم، نقل شرائح مشطف إلى غرفة حضانة أخرى.انتظر أكثر من ساعة واحدة للتعافي قبل التجربة. لبدء هذا الإجراء، قم بتشغيل مكبر الصوت والكمبيوتر ونظام الكاميرا وافتح البرنامج. صب ACSF في أنبوب 50 ملليلتر وفقاعات مع كاربوجين.استخدام مضخة ال peristaltic لتعميم ACSF وضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من ملليلتر في الدقيقة الواحدة. ثم، ضبط ارتفاع ماصة الشفط بحيث مستوى السائل داخل غرفة التجربة هو ثابت دائما. ضع القطب الأرضي في الغرفة.في وقت لاحق، تعبئة القطب الزجاجي مع كمية صغيرة من ACSF ووضعها في حامل القطب. إرفاق حامل لقضيب المتلاعب. باستخدام مكبر للصوت، تأكد من أن مقاومة القطب الكهربائي هو ما يقرب من ميجام.في جلسة التسجيل، قم بنقل شريحة من الغرفة الرطبة إلى غرفة تجريبية. اضغط على حافة الحلبة بقوة في سيليكون س- حلقة. يجب الحرص على عدم كسر الغشاء أو الجزء السفلي من غرفة التجربة.تحت المجهر مكان غيض من القطب المحفزة وأقطاب تسجيل حقل ممكن على شريحة. تحقق من الاستجابة التي أثارتها من خلال تقديم حافز. تأكد من أن مجال الرؤية يغطي الدائرة العصبية الصحيحة في نظام التسجيل البصري.بعد ذلك، ضبط شدة ضوء الإثارة إلى ما يقرب من 70 إلى 80٪ من القدرة القصوى في الكاميرا. باستخدام مصدر الضوء الفلورسنت، ضبط التركيز مع نظام الامتلاك. ثم، بدء التسجيل وتحليل البيانات في برنامج الحصول على صورة بعد الاستحواذ.هذا الرقم يظهر إشارة بصرية تمثيلية على التحفيز الكهربائي من collaterol شيفر في منطقة CA1 من شريحة فرس النهر الماوس. وتظهر هذه الصور المتتالية الإشارة البصرية قبل أن يتم تطبيق أي مرشحات سفبية وزمنية بينما تظهر هذه الصور نفس البيانات بعد تطبيق خمسة في خمسة مرشح مكعب مرتين. بسبب ارتفاع معدل الإطار ودقة المكانية العالية ، فإن تطبيق المرشح لم يغير الإشارة ، ولكن تمت تصفيتها من الضوضاء التي يمكن ملاحظتها أيضًا في الدورة الزمنية المسجلة بالبكسل في تجربة واحدة.هنا مقارنة الاستجابات النموذجية في منطقة CA1 من شرائح فرس النهر بين الفأر والجرذ. لوحظت الاستجابة الصغيرة لفرط الأقطاب في الجانب القعد من CA1 بعد 24 مللي ثانية في شريحة فرس النهر للماوس ، ولكن استجابة أكثر ضخامة للأقطاب تجاوزت الاستجابة المزيلة في شريحة فرس النهر الفئران. مرة واحدة هي ملطخة شرائح، ينبغي أن تستمر لأكثر من 12 ساعة ويمكنك إجراء التسجيلات الكهربائية الأخرى عليها.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

التصوير الضوئي للخلايا العصبية في العقدة كراب فموي معدي مع الجهد حساسة للملونات

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselective Biolistic استهداف عضوي في الدماغ شرائح باستخدام بندقية الجينات المعدلة

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

إجراء حج القحف الجانبي الكبير ل ميسوسكيل التصوير البصري الميداني واسعة النطاق من نشاط الدماغ

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

تسجيل إيغ في التحرك بحرية الفئران حديثي الولادة باستخدام طريقة رواية

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ القوارض شرائح بالإضافة إلى صفائف ميكروليكترودي

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...