Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT modtog JSPS KAKENHI-tilskuddet (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskud fra ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering.

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af Udvalget for dyrepasning og-brug på Tokushima Bunri Universitet. Følgende protokol til skive forberedelse er næsten en standardprocedure27 , men ændringerne har været protokollerne af farvning og optagelse med VSD.
1. forberedelse før eksperimentets dag
<ol><li>Forbered bestanden A (tabel 1), lager B (tabel 2) og lager C (tabel 3) opløsninger o...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

Udsnittet fysiologi er afgørende for at indsamle det rigtige signal. Brugen af ring membranfilter systemet i denne protokol sikrer, at udsnittet forbliver sundt og un-forvrænget under hele proceduren2,16,17. Andre systemer kan bruges til at bevare skive fysiologi under optagelsen, men udsnittet bør ikke blive deformeret på noget tidspunkt, da billeddiagnostik behøver alle dele af udsnittet for at være sundt. Ring-membranfi...

Wide-felt enkelt photon spændings følsom farvestof (VSD) Imaging af bulk-farvede hjernen skive præparater er blevet et nyttigt kvantitativt redskab til at vurdere dynamikken i neurale kredsløb1,2,3,4 . Efter analysen af ændringerne i optiske egenskaber på grund af membran excitation5,6,7, VSD Imaging blev først beskrevet i begyndelsen af 1970 ' erne af Cohen og andre6,8, 9.; Det er en passende metode til at overvåge hjernens funktioner i realtid, da farvestoffet direkte sonerer membranens potentielle ændringer (dvs. det primære signal fra neuronerne).
De tidligste Vsd'er besad de ønskværdige egenskaber til at forstå hjernen systemet, såsom en hurtig tid-konstant til at følge den hurtige kinetik af neuronal membran potentielle hændelser, og linearitet med ændringen i membran potentiale9, 10 stk. , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14 ud af , 15. svarende til andre Imaging eksperimenter, denne teknik kræver en bred vifte af specifikke tunings, såsom kameraer, optik, software, og skive fysiologi, for at opnå de ønskede resultater. På grund af disse tekniske faldgruber, de forventede fordele under den indledende indsats ikke nødvendigvis materialiserer for de fleste af de laboratorier, der ikke specialiserer sig i denne teknik.
Den primale årsag til de tekniske vanskeligheder var den lave følsomhed af VSD mod membranen potentiel ændring, når den anvendes til bulk farvning af skive præparater. Størrelsen af det optiske signal (dvs. fraktioneret ændring i fluorescens) er normalt 10-4-10-3 af kontrol (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskalaen for membran potentiel ændring i en neuron er ca. millisekunder til få hundreder af millisekunder. For at måle ændringer i membran potentialet af Neuron, skal kameraet, der anvendes til optagelsen være i stand til at erhverve billeder med høj hastighed (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomhed af VSD og den hastighed, der kræves for at følge det neurale signal kræver en stor mængde lys, der skal indsamles på kameraet ved en høj hastighed, med et højt signal-støj-forhold (S/N)2,16.
Den optik af optagelsen systemet er også et afgørende element for at sikre indsamling af tilstrækkelig lys og til at forbedre S/N. Den forstørrelse opnået ved optikken er ofte alt for lav, såsom 1X til 10X, at visualisere en lokal funktionel neurale kredsløb. For eksempel, at visualisere dynamikken i hippocampus kredsløb, en forstørrelse på ca. 5 ville være egnet. En sådan lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor ville avanceret optik være gavnlig for en sådan optagelse.
Desuden er Skive fysiologi også afgørende. Da billedbehandlings analysen kræver, at skiverne skal være intakte, er det nødvendigt med omhyggelig skive håndtering17. Desuden er de foranstaltninger, der er truffet for at opretholde udsnittets levedygtighed i længere tid, vigtige18.
Den nuværende artikel beskriver protokollen til forberedelse af skiver, VSD farvning, og målinger. Artiklen skitserer også forbedringerne til Vsd'er, billedenhed, og optik, og andre yderligere raffinementer til det eksperimentelle system, der har aktiveret denne metode, der skal anvendes som en ligetil, kraftfuld, og kvantitativ analyse til visualisering af ændring af hjernens funktioner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også anvendes i vid udstrækning til langsigtede potensering i1-området af hippocampale skiver 1. Desuden er denne teknik også nyttig i optisk optagelse af membran potentialer i en enkelt nerve celle26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

Wide-felt enkelt photon spændings følsomt farvestof (VSD) billeddannelse af hjernen skive præparater er et nyttigt redskab til at vurdere den funktionelle konnektivitet i neurale kredsløb. På grund af den fraktioneret ændring i lys signalet, har det været vanskeligt at bruge denne metode som en kvantitativ analyse. Denne artikel beskriver specielle optik-og skive håndteringssystemer, som gør denne teknik stabil og pålidelig. Den nuværende artikel demonstrerer udsnittet håndtering, farvning, og optagelse af VSD-farvede hippocampus skiver i detaljer. Systemet opretholder fysiologiske forhold i lang tid, med god farvning, og forhindrer mekaniske bevægelser af udsnittet under optagelserne. Desuden gør det muligt farvning af skiver med en lille mængde af farvestoffet. Optikken opnår høj numerisk blænde ved lav forstørrelse, hvilket gør det muligt at optage VSD-signalet ved den maksimale billedhastighed på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumlig opløsning. På grund af den høje billedhastighed og rumlige opløsning, tillader denne teknik anvendelse af efter optagelses filtre, der giver et tilstrækkeligt signal-støjforhold til at vurdere ændringerne i neurale kredsløb.

Figur 5 viser det repræsentative optiske signal ved elektrisk stimulering af Schaffer-sikkerheden i område carbid af en mus hippocampus skive. De fortløbende billeder i figur 5a viser det optiske signal, før der blev anvendt rumlige og tidsmæssige filtre, mens figur 5b viser de samme data efter påføring af et 5 x 5 x 5 kubik filter (en Gaussisk kerne konvolution, 5 x 5 rumlig-og 5 til tidsmæs...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Vi introducerer en reproducerbar og stabil optisk optagelsesmetode til hjerne skiver ved hjælp af spændings følsom farve. Artiklen beskriver spændings følsom farvning af farvestoffer og registrering af optiske signaler ved hjælp af konventionelle hippocampale skive præparater.

Wide-felt enkelt-photon optisk optagelse i hjernen skiver ved hjælp af spændings følsom Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Den optiske optagelse metode med spændingsfølsomme farvestof menes at være en ideel teknologi til at visualisere, hvordan hjernen fungerer. Denne metode tillod os at registrere en neuropsychic dynamik stabilt og pålideligt over 12 timer, givet os et syn på psykisk aktivitet. Vi forsøger at udvide programmet til at opdage kredsløb ændringer forårsaget af kemikalier på alle stadier af udviklingen, såsom værdifuld syre ansøgning til mødre.Teknikken er allerede veletableret. Prøv at reproducere undersøgelser ved at følge den metode, der præsenteres her. For at begynde denne procedure skal det halshuggede hoved nedsænkes i iskold ACSF i en kirurgisk bakke i rustfrit stål.Uddrag hjernen inden for et minut og læg den i et bægerglas, der indeholder kølet ACSF i fem minutter. Dernæst opdele hjernen sektion på midterlinjen med en skalpel og placere begge halvkugler på en 4% agar blok. Derefter placere hjernen blok med begge halvkugler på en 4% agar blok.Tør den overskydende ACSF af blokken med filterpapir. Anvend efterfølgende superlim på vibratomeplatformen. Anlæg agarblokken på den, og tør det overdrevne klæbemiddel af med et filterpapir.Forsigtigt anvende en lille mængde iskold ACSF fra toppen af hjernen agar blok til at hjælpe størkne overskydende superlim og for at forhindre limen i at dække hjernen og forstyrre udskæring. Derefter fastgøres platformen til vibratomebakken, og den modificerede ACSF hældes. Indstil vibratomen til en langsom hastighed, og hav klingefrekvensen på den maksimale indstilling.Så begynd at skære. Placer skiverne i hjørnet af udsnitskammeret i rækkefølge, så skivernes rækkefølge let kan skelnes fra. Normalt tre til fem skiver kan fås fra en halvkugle.Dernæst afbrød hjernestammen del ved hjælp af en 30 gauge nål. Ved hjælp af en lille spids pensel, placere skiven på membranfilteret holdt med en plexiglas ring. Anstænke ringen i et fugtigt bjærgningskammer, og fastgør dækslet for at holde det indre tryk højt.Når skiven placeres på membranfilteret, skal du justere skivens retning og placering i ringen for at sikre, at den er godt centreret og har en ensartet retning. Lad prøven være 28 grader Celsius i 30 minutter og derefter ved stuetemperatur i mindst 10 til 30 minutter til bjærgning. For at plette skiverne påføres forsigtigt 100 mikroliter af farvningsopløsningen på hver skive og inkuberes ved 20 minutter for stuetemperatur.Derefter forberedes 50 til 100 milliliter ACSF i en container. Anlækningsopløsningen med prøven i den for at skylle farvningsopløsningen. Derefter overføres de skyllede skiver til et andet inkubationskammer.Vent mere end en time på helbredelse før eksperimentet. Hvis du vil starte denne procedure, skal du tænde for forstærkeren, computeren og kamerasystemet og åbne softwaren. Hæld ACSF i et 50 milliliterrør og boble det med carbogen.Brug en peristaltisk pumpe til at cirkulere ACSF og justere strømningshastigheden til ca. en milliliter pr. minut. Juster derefter højden af sugerøret, så væskeniveauet inde i eksperimentkammeret altid er konstant. Læg jordelektroden i kammeret.Fyld derefter glaselektroden med en lille mængde ACSF, og læg den i elektrodeholderen. Fastgør holderen til manipulatorens stang. Ved hjælp af en forstærker skal du sikre dig, at elektrodemodstanden er ca. en megaohm.I optagelsessessionen skal du overføre en skive fra det fugtige kammer til et eksperimentelt kammer. Tryk ringens kant fast ind i silikone o-ringen. Pas på ikke at bryde membranen eller bunden af eksperimentkammeret.Under mikroskopet skal spidsen af den stimulerende elektrode og feltpotelektroden være på skiven. Tjek den fremkaldte reaktion ved at levere en stimulus. Bekræft, at synsfeltet dækker det rigtige neurale kredsløb i det optiske optagesystem.Juster derefter excitationslysintensiteten til ca. 70 til 80 % af den maksimale kapacitet ved kameraet. Brug lysstofkilden til at justere fokus med anskaffelsessystemet. Start derefter optagelsen, og analyser dataene i en billedopkøbssoftware efter anskaffelsen.Denne figur viser det repræsentative optiske signal ved elektrisk stimulering af Schaffer collaterol i område CA1 af en mus hippocampal skive. Disse på hinanden følgende billeder viser det optiske signal, før nogen spacial og tidsmæssige filtre blev anvendt, mens disse billeder viser de samme data efter anvendelse af en fem af fem af fem kubiske filter to gange. På grund af den høje billedhastighed og høje rumlige opløsning, har anvendelsen af filteret ikke ændre signalet, men filtreret den støj, som også kan observeres i den tid, der er registreret i pixels i et enkelt forsøg.Her er sammenligningen af de typiske reaktioner i område CA1 af hippocampal skiver mellem mus og rotte. Den lille hyperpolarizing respons er observeret i den distale side af CA1 efter 24 millisekunder i musen hippocampal skive, men mere massive hyperpolarizing respons overhalede depolarizing svar i rotte hippocampal skive. Når skiverne er plettet, bør de vare i over 12 timer, og du kan udføre andre elektrofysiologiske optagelser på dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spændingsfølsomme Dye Optagelse fra axoner, dendritter og dendrit udløberne af individuelle neuroner i hjernen Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Målretning i organotypisk Brain Skiver anvendelse af en modificeret genpistol

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

En stor lateral kraniotomiprocedure for mesoscale bredfelt optisk billeddannelse af hjerneaktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Forberedelse af akut hjernen skiver bruger en optimeret N-Methyl-D-glucamine beskyttende genoprettelsesmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-celle Patch-clamp Optagelser i Brain Skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Optagelse af EEG i frit bevægende neonatale rotter ved hjælp af en ny metode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Optagelse og graduering af Epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver koblet til mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...