Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT ontving de JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, en JP15K00413) uit MEXT en subsidies van het ministerie van volksgezondheid, arbeid en welzijn (MHLW-Kagaku-Ippan-H27 [15570760] en H30 [18062156]). Wij willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor het bewerken van het Engels.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van Tokushima Bunri University. Het volgende protocol voor slice voorbereiding is bijna een standaard procedure27 , maar de wijzigingen zijn de protocollen van kleuring en opname met de Vanhoof.
1. voorbereiding voor de dag van het experiment
<ol><li>Bereid de voorraad A (tabel 1), voorraad B (tabel 2), en Stock C (ta...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

De slice fysiologie is van vitaal belang voor het verzamelen van het juiste signaal. Het gebruik van het ring-membraanfilter systeem in dit protocol zorgt ervoor dat het segment gezond en onvervormd blijft gedurende de procedure2,16,17. Andere systemen kunnen worden gebruikt om segment fysiologie te behouden tijdens de opname, maar de slice moet niet vervormd te krijgen op elk moment als de beeldvorming moet elk deel van het seg...

Wide-veld Single Photon voltage-Sensitive Dye (Vanhoof) beeldvorming van bulk-gekleurde hersenen slice preparaten is uitgegroeid tot een nuttig kwantitatief instrument om de dynamiek van de neurale circuits1,2,3,4 te beoordelen . Na de analyse van de veranderingen in optische eigenschappen toe te schrijven aan membraan opwinding5,6,7, werd de weergave van Vanhoof eerst beschreven in de vroege jaren ' 70 door Cohen en anderen6,8, 9.; het is een geschikte methode om de hersenen functies in real-time te controleren als de kleurstof direct sondes het membraan potentiële veranderingen (dat wil zeggen, het primaire signaal van de neuronen).
Vroegste VSDs bezat de wenselijke kenmerken om het hersenen systeem, zoals een snelle tijd-constante te begrijpen om de snelle kinetica van neuronale membraan potentiële gebeurtenissen te volgen, en lineariteit met de verandering in membraan potentieel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. vergelijkbaar met andere Imaging experimenten, deze techniek vereist een breed scala van specifieke tunings, zoals de camera's, optica, software, en slice fysiologie, om de gewenste resultaten te bereiken. Vanwege deze technische valkuilen, de verwachte voordelen tijdens de initiële inspanningen niet noodzakelijkerwijs materialiseren voor de meeste van de laboratoria die niet gespecialiseerd in deze techniek.
De oorspronkelijke oorzaak van de technische moeilijkheid was de lage gevoeligheid van de VANHOOF in de richting van het membraan potentiële verandering wanneer toegepast op bulk kleuring van slice preparaten. De grootte van het optische signaal (d.w.z., de verwaarloosbare verandering in fluorescentie) is gewoonlijk 10-4-10-3 van het signaal van de controle (F0) onder fysiologische voorwaarden. De tijdschaal van membraanpotentiaal verandering in een neuron is ongeveer milliseconden tot enkele honderden milliseconden. Voor het meten van de veranderingen in het membraan potentieel van het neuron, de camera wordt gebruikt voor de opname moet in staat zijn om beelden te verwerven met hoge snelheid (10 kHz tot 100 Hz). De lage gevoeligheid van de Vanhoof en de snelheid die nodig is om het neurale signaal te volgen, vereist een grote hoeveelheid licht die bij de camera op hoge snelheid moet worden verzameld, met een hoge signaal-ruisverhouding (S/N)2,16.
De optica van het opnamesysteem is ook een kritisch element om inzameling van voldoende licht te verzekeren en S/N te verbeteren. De vergroting bereikt door de optiek is vaak overdreven laag, zoals 1X tot 10X, om een lokale functionele neurale circuit te visualiseren. Bijvoorbeeld om de dynamiek van het hippocampale circuit te visualiseren, zou een vergroting van ongeveer 5 geschikt zijn. Dergelijke lage vergroting heeft lage fluorescentie efficiency; Daarom zou geavanceerde optiek gunstig zijn voor een dergelijke opname.
Daarnaast is de slice fysiologie is ook van essentieel belang. Aangezien de Imaging-analyse vereist dat de plakjes intact zijn, is zorgvuldige slice handling nodig17. Bovendien zijn maatregelen genomen om de slice levensvatbaarheid voor een langere tijd te handhaven belangrijk18.
Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor de voorbereiding van plakjes, VANHOOF kleuring en metingen. Het artikel schetst ook de verbeteringen aan de VSDs, imaging-apparaat, en optica, en andere extra verfijningen aan de experimentele systeem dat hebben ingeschakeld deze methode te worden gebruikt als een eenvoudige, krachtige en kwantitatieve assay voor het visualiseren van de wijziging van de hersenen functies19,20,21,22,23,24,25. De techniek kan ook op grote schaal worden gebruikt voor lange termijn potentiëring in de CA1 gebied van hippocampale slices1. Bovendien, deze techniek is ook nuttig bij optische opname van membraanpotentiaal in een enkele zenuwcel26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

Wide-veld single foton voltage-Sensitive Dye (VANHOOF) Imaging van de hersenen slice preparaten is een nuttig instrument om de functionele connectiviteit in neurale circuits te beoordelen. Wegens de verwaarloosbare verandering in het lichtsignaal, is het moeilijk geweest om deze methode als kwantitatieve analyse te gebruiken. Dit artikel beschrijft speciale optica en slice handling systemen, die deze techniek stabiel en betrouwbaar maken. Het huidige artikel toont de slice handling, kleuring, en de opname van de VANHOOF-gekleurd hippocampale plakjes in detail. Het systeem handhaaft lange tijd fysiologische voorwaarden, met het goede bevlekken, en verhindert mechanische bewegingen van het segment tijdens de opnamen. Bovendien maakt het kleuring van plakjes met een kleine hoeveelheid van de kleurstof. De optica bereiken hoge numerieke diafragma bij lage vergroting, die het mogelijk maakt de opname van de VANHOOF signaal op de maximale frame rate van 10 kHz, met 100 pixel x 100-pixel ruimtelijke resolutie. Door de hoge frame rate en ruimtelijke resolutie, deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de post-Recording filters die voldoende signaal-ruisverhouding te bieden aan de veranderingen in de neurale circuits te beoordelen.

Figuur 5 toont de representatieve optische signaal op elektrische stimulatie van de Schaffer onderpand in gebied Ca1 van een muis hippocampale slice. De opeenvolgende beelden in figuur 5a tonen het optische signaal voordat er ruimtelijke en temporele filters werden toegepast, terwijl Figuur 5b dezelfde gegevens toont na het aanbrengen van een 5 x 5 x 5 kubieke filter (een Gaussische kernel-winding, 5...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.

Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

De optische opname methode met spanning gevoelige kleurstof wordt beschouwd als een ideale technologie om te visualiseren hoe de hersenen werken. Deze methode stelde ons in staat om een neuropsychische dynamiek stabiel en betrouwbaar op te nemen gedurende 12 uur, gaf ons een visie op psychische activiteit. We proberen de toepassing uit te breiden om circuitveranderingen veroorzaakt door chemische stoffen in het hele ontwikkelingsstadium te detecteren, zoals waardevolle zuurtoepassing voor moeders.De techniek is al goed ingeburgerd. Probeer studies te reproduceren door het volgen van de methode hier gepresenteerd. Om deze procedure te beginnen, dompel de onthoofde kop onder in ijskoude ACSF in een roestvrijstalen chirurgische lade.Haal de hersenen binnen een minuut en plaats het in een beker met gekoelde ACSF gedurende vijf minuten. Vervolgens verdeel de hersensectie op de middellijn met een scalpel en plaats beide hemisferen op een blok van 4%agar. Plaats vervolgens het hersenblok met beide hersenhelften op een blok van 4%agar.Veeg de overtollige ACSF uit het blok met een filterpapier. Breng vervolgens superlijm aan op het vibratome-platform. Plaats het agarblok erop en veeg de overmatige lijm af met een filterpapier.Breng voorzichtig een kleine hoeveelheid ijskoude ACSF van de bovenkant van de hersenen agar blok te helpen stollen overtollige superlijm en om te voorkomen dat de lijm van het bedekken van de hersenen en het verstoren van de snijden. Bevestig daarna het platform aan de vibratomelade en giet de aangepaste ACSF. Stel het vibratome in op een lage snelheid en laat de bladfrequentie op de maximale stand staan.Begin dan met snijden. Plaats de segmenten in de hoek van de snijkamer in volgorde, zodat de volgorde van de plakjes gemakkelijk kan worden onderscheiden. Gewoonlijk kunnen drie tot vijf plakken van één hemisfeer worden verkregen.Vervolgens afgesneden van de hersenstam gedeelte met behulp van een 30-meter naald. Met behulp van een kleine tip penseel, plaats het segment op het membraan filter gehouden met een plexiglas ring. Plaats de ring in een vochtige herstelkamer en zet de afdekking vast om de binnendruk hoog te houden.Bij het plaatsen van het segment op het membraanfilter, pas de richting en positie van het segment binnen de ring om ervoor te zorgen dat het goed gecentreerd is en een consistente richting heeft. Laat het monster 30 minuten op 28 graden Celsius staan en vervolgens minstens 10 tot 30 minuten op kamertemperatuur voor herstel. Om de plakjes te bevlekken, breng voorzichtig 100 microliters van de kleuroplossing aan op elk plakje en broed op 20 minuten voor kamertemperatuur.Bereid vervolgens 50 tot 100 milliliter ACSF in een container. Plaats de ring met het monster erin om de kleuroplossing te spoelen. Breng vervolgens de gespoelde plakjes over naar een andere incubatiekamer.Wacht meer dan een uur voor herstel voor het experiment. Schakel om deze procedure te starten het versterker-, computer- en camerasysteem in en open de software. Giet ACSF in een 50 milliliter buis en bel het met carbogen.Gebruik een peristaltische pomp om de ACSF te laten circuleren en pas de stroomsnelheid aan op ongeveer een milliliter per minuut. Stel vervolgens de hoogte van de zuigpijp aan, zodat het vloeistofniveau in de experimentkamer altijd constant is. Plaats de grondelektrode in de kamer.Vul vervolgens de glaselektrode met een kleine hoeveelheid ACSF en plaats deze in de elektrodehouder. Bevestig de houder aan de staaf van de manipulator. Met behulp van een versterker, zorg ervoor dat de elektrode weerstand is ongeveer een megaohm.Breng in de opnamesessie een stuk van de vochtige kamer over naar een experimentele kamer. Druk de rand van de ring stevig in de siliconen o-ring. Zorg ervoor dat u het membraan of de onderkant van de experimentkamer niet breekt.Plaats onder de microscoop de punt van de stimulerende elektrode en het veldpotentieel opnameelektrode op de slice. Controleer de opgeroepen reactie door het leveren van een stimulus. Controleer of het gezichtsveld het juiste neurale circuit in het optische opnamesysteem bedekt.Pas vervolgens de excitatielichtintensiteit aan op ongeveer 70 tot 80% van de maximale capaciteit van de camera. Pas met de fluorescerende lichtbron de focus aan met het acquisitiesysteem. Start vervolgens de opname en analyseer de gegevens in een software voor het verkrijgen van afbeeldingen na de overname.Dit cijfer toont het representatieve optische signaal op elektrostimulatie van Schaffer collaterol in gebied CA1 van een plakje van de muis hippocampal. Deze opeenvolgende beelden tonen het optische signaal voordat een ruimtelijke en temporele filters werden toegepast, terwijl deze beelden tonen dezelfde gegevens na het toepassen van een vijf bij vijf bij vijf kubieke filter twee keer. Vanwege de hoge framesnelheid en hoge ruimtelijke resolutie heeft de toepassing van het filter het signaal niet veranderd, maar het geluid eruit gefilterd dat ook kan worden waargenomen in de tijdskoers die in pixels in één proef is opgenomen.Hier is de vergelijking van de typische reacties in gebied CA1 van de hippocampal plakjes tussen muis en rat. De kleine hyperpolariserende respons wordt waargenomen in de distale kant van de CA1 na 24 milliseconden in de muis hippocampal slice, maar meer massieve hyperpolariserende reactie overviel de depolariserende reactie in de rat hippocampal slice. Zodra de plakjes zijn gekleurd, moeten ze duren voor meer dan 12 uur en u andere elektrofysiologische opnames op hen uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselectieve Biolistische Targeting in Organotypische Brain Plakjes met een aangepaste Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Een grote laterale kraniotomie procedure voor mesoscale breedbeeld optische beeldvorming van hersenactiviteit

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG opnemen bij vrij bewegende neonatale ratten met behulp van een nieuwe methode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...