Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT a reçu la subvention JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, et JP15K00413) de MEXT et des subventions du Ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] et H30 [18062156]). Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l'édition en anglais.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Tokushima Bunri. Le protocole suivant pour la préparation des tranches est presque une procédure standard27 , mais les modifications ont été les protocoles de coloration et d'enregistrement avec VSD.
1. Préparation avant le jour de l'expérience
<ol><li>Préparer le stock A (tableau 1</stro...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

La physiologie de la tranche est essentielle pour recueillir le bon signal. L'utilisation du système de filtre à membrane d'anneau dans ce protocole garantit que la tranche reste saine et non déformée tout au long de la procédure2,16,17. D'autres systèmes peuvent être utilisés pour conserver la physiologie des tranches pendant l'enregistrement, mais la tranche ne doit pas se déformer à tout moment que l'imagerie a beso...

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau tachées en vrac est devenue un outil quantitatif utile pour évaluer la dynamique des circuits neuronaux1,2,3,3 . Après l'analyse des changements dans les propriétés optiques dues à l'excitation de membrane5,6,7, l'imagerie VSD a été décrite pour la première fois au début des années 1970 par Cohen et d'autres6,8, 9. .; il s'agit d'une méthode appropriée pour surveiller les fonctions cérébrales en temps réel, car le colorant sonde directement les changements potentiels de la membrane (c.-à-d., le signal principal des neurones).
Les premiers VSD possédaient les caractéristiques souhaitables pour comprendre le système cérébral, comme un temps-constant rapide pour suivre la cinétique rapide des événements potentiels de membrane neuronale, et la linéarité avec le changement dans le potentiel de membrane9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. Semblable à d'autres expériences d'imagerie, cette technique nécessite un large éventail de accords spécifiques, tels que les caméras, l'optique, le logiciel et la physiologie des tranches, pour obtenir les résultats souhaités. En raison de ces écueils techniques, les avantages attendus au cours des efforts initiaux ne se sont pas nécessairement matérialisés pour la plupart des laboratoires qui ne se spécialisaient pas dans cette technique.
La cause première de la difficulté technique était la faible sensibilité du VSD vers le changement potentiel de membrane une fois appliqué à la coloration en vrac des préparations de tranche. L'ampleur du signal optique (c.-à-d. le changement fractionnaire de la fluorescence) est habituellement de 10-4-10-3 du signal de contrôle (F0) dans des conditions physiologiques. L'échelle temporelle du changement potentiel de membrane dans un neurone est d'environ millisecondes à quelques centaines de millisecondes. Pour mesurer les changements dans le potentiel membranaire du neurone, la caméra utilisée pour l'enregistrement devrait être en mesure d'acquérir des images à grande vitesse (10 kHz à 100 Hz). La faible sensibilité de VSD et la vitesse nécessaire pour suivre le signal neuronal nécessite une grande quantité de lumière à recueillir à la caméra à grande vitesse, avec un rapport signal-bruit élevé (S/N)2,16.
L'optique du système d'enregistrement est également un élément essentiel pour assurer la collecte de suffisamment de lumière et pour améliorer S /N. Le grossissement réalisé par l'optique est souvent excessivement faible, comme 1X à 10X, pour visualiser un circuit neuronal fonctionnel local. Par exemple, pour visualiser la dynamique du circuit hippocampique, un grossissement d'environ 5 serait approprié. Un tel grossissement faible a une faible efficacité de fluorescence; par conséquent, l'optique avancée serait bénéfique pour un tel enregistrement.
En outre, la physiologie de tranche est également essentielle. Étant donné que l'analyse d'imagerie exige que les tranches soient intactes, une manipulation soigneuse des tranches est nécessaire17. En outre, les mesures prises pour maintenir la viabilité de la tranche pour une plus longue période sont importantes18.
Le présent article décrit le protocole pour la préparation des tranches, la coloration VSD, et les mesures. L'article décrit également les améliorations apportées aux VSD, aux appareils d'imagerie et à l'optique, ainsi que d'autres améliorations supplémentaires au système expérimental qui ont permis d'utiliser cette méthode comme un test simple, puissant et quantitatif pour visualiser le modification des fonctions cérébrales19,20,21,22,23,24,25. La technique peut également être largement utilisée pour la potentialisation à long terme dans la zone CA1 des tranches hippocampal1. En outre, cette technique est également utile dans l'enregistrement optique des potentiels membranaires dans une seule cellule nerveuse26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau est un outil utile pour évaluer la connectivité fonctionnelle dans les circuits neuronaux. En raison du changement fractionnaire dans le signal lumineux, il a été difficile d'utiliser cette méthode comme un essai quantitatif. Cet article décrit des systèmes spéciaux d'optique et de manipulation de tranches, qui rendent cette technique stable et fiable. Le présent article montre la manipulation de la tranche, la coloration et l'enregistrement des tranches hippocampales tachées de VSD en détail. Le système maintient des conditions physiologiques pendant une longue période, avec une bonne coloration, et empêche les mouvements mécaniques de la tranche pendant les enregistrements. En outre, il permet la coloration des tranches avec une petite quantité de colorant. L'optique atteint une ouverture numérique élevée à faible grossissement, ce qui permet l'enregistrement du signal VSD à la vitesse maximale de 10 kHz, avec une résolution spatiale de 100 pixels x 100 pixels. En raison de la fréquence de trame élevée et de la résolution spatiale, cette technique permet l'application des filtres post-enregistrement qui fournissent un rapport signal-bruit suffisant pour évaluer les changements dans les circuits neuronaux.

La figure 5 montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique de la garantie Schaffer dans la zone CA1 d'une tranche hippocampal de souris. Les images consécutives de la figure 5A montrent le signal optique avant l'application de filtres spatiaux et temporels, tandis que la figure 5B montre les mêmes données après l'application d'un filtre cubique 5 x 5 x 5 (une convoluti...

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Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Nous introduisons une méthode d'enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l'aide de colorant sensible à la tension. L'article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l'enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.

Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

La méthode d’enregistrement optique avec colorant sensible à la tension est considérée comme une technologie idéale pour visualiser le fonctionnement du cerveau. Cette méthode nous a permis d’enregistrer une dynamique neuropsychique de façon stably et fiable sur 12 heures, nous a donné un point de vue sur l’activité psychique. Nous essayons d’élargir l’application pour détecter les changements de circuit causés par les produits chimiques à toutes les étapes du développement, comme l’application d’acide précieux aux mères.La technique est déjà bien établie. S’il vous plaît essayer de reproduire les études en suivant la méthode présentée ici. Pour commencer cette procédure, immerger la tête décapitée dans l’ACSF glacé dans un plateau chirurgical en acier inoxydable.Extraire le cerveau en une minute et le placer dans un bécher contenant de l’ACSF réfrigéré pendant cinq minutes. Ensuite, divisez la section du cerveau à la ligne médiane avec un scalpel et placez les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%. Ensuite, placez le bloc cérébral avec les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%.Essuyer l’excès d’ACSF du bloc à l’aide d’un papier filtre. Par la suite, appliquez de la superglue sur la plate-forme vibratoire. Placez le bloc d’agar dessus et essuyez l’adhésif excessif avec un papier filtre.Appliquez doucement une petite quantité d’ACSF glacé à partir du haut du bloc d’agar du cerveau pour aider à solidifier l’excès de superglue et pour empêcher la colle de couvrir le cerveau et de perturber le tranchage. Par la suite, fixez la plate-forme au plateau vibratoire et versez l’ACSF modifié. Réglez le vibratome à une vitesse lente et avoir la fréquence de la lame à son réglage maximum.Ensuite, commencez à trancher. Placez les tranches dans le coin de la chambre de tranche dans l’ordre de sorte que l’ordre des tranches puisse être facilement distingué. Habituellement, trois à cinq tranches peuvent être obtenues à partir d’un hémisphère.Ensuite, coupez la partie du tronc cérébral à l’aide d’une aiguille de calibre 30. À l’aide d’un petit pinceau à pointes, placez la tranche sur le filtre membranaire retenu avec un anneau en plexiglas. Placez l’anneau dans une chambre de récupération humide et fixez le couvercle pour maintenir la pression intérieure élevée.Lorsque vous placez la tranche sur le filtre membranaire, ajustez la direction et la position de la tranche à l’intérieur de l’anneau pour vous assurer qu’elle est bien centrée et qu’elle a une direction uniforme. Laissez le spécimen à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à température ambiante pendant au moins 10 à 30 minutes pour la récupération. Pour tacher les tranches, appliquer délicatement 100 microlitres de la solution de coloration sur chaque tranche et incuber à 20 minutes pour la température ambiante.Ensuite, préparez 50 à 100 millilitres d’ACSF dans un récipient. Placez l’anneau avec le spécimen dedans pour rincer la solution de coloration. Ensuite, transférez les tranches rincées dans une autre chambre d’incubation.Attendez plus d’une heure pour récupérer avant l’expérience. Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, l’ordinateur et le système de caméra et ouvrez le logiciel. Verser l’ACSF dans un tube de 50 millilitres et le bouillonner de carbogen.Utilisez une pompe périssaltique pour faire circuler l’ACSF et ajuster le débit à environ un millilitre par minute. Ensuite, ajustez la hauteur de la pipette d’aspiration de sorte que le niveau liquide à l’intérieur de la chambre d’expérience est toujours constant. Placez l’électrode au sol dans la chambre.Par la suite, remplissez l’électrode de verre avec une petite quantité d’ACSF et placez-la dans le support d’électrode. Attachez le support à la tige du manipulateur. À l’aide d’un amplificateur, assurez-vous que la résistance aux électrodes est d’environ un mégaohm.Dans la session d’enregistrement, transférer une tranche de la chambre humide à une chambre expérimentale. Appuyez fermement sur le bord de l’anneau dans l’anneau en silicone. Veillez à ne pas briser la membrane ou le fond de la chambre d’expérimentation.Sous le microscope placer la pointe de l’électrode stimulante et l’électrode d’enregistrement potentiel sur le terrain sur la tranche. Vérifiez la réponse évoquée en fournissant un stimulus. Confirmez que le champ de vision couvre le circuit neuronal droit dans le système d’enregistrement optique.Ensuite, ajustez l’intensité lumineuse d’excitation à environ 70 à 80% de la capacité maximale de la caméra. À l’aide de la source de lumière fluorescente, réglez la mise au point avec le système d’acquisition. Ensuite, démarrez l’enregistrement et analysez les données dans un logiciel d’acquisition d’images après l’acquisition.Ce chiffre montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique du collaterol schaffer dans la zone CA1 d’une tranche hippocampale de souris. Ces images consécutives montrent le signal optique avant que des filtres spacial et temporels aient été appliqués tandis que ces images montrent les mêmes données après application d’un filtre cube cinq par cinq par cinq deux fois. En raison de la vitesse d’image élevée et de la haute résolution spatiale, l’application du filtre n’a pas changé le signal, mais filtré le bruit qui peut également être observé dans le cours du temps enregistré en pixels dans un seul essai.Voici la comparaison des réponses typiques dans la zone CA1 des tranches hippocampiques entre la souris et le rat. La petite réponse hyperpolarisante est observée dans le côté distal du CA1 après 24 millisecondes dans la tranche hippocampal de souris, mais la réponse hyperpolarisante plus massive a dépassé la réponse dépolarisante dans la tranche hippocampal de rat. Une fois que les tranches sont tachées, elles devraient durer plus de 12 heures et vous pouvez effectuer d’autres enregistrements électrophysiologiques sur eux.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Imagerie optique des neurones dans le ganglion de crabe Stomatogastric avec tension colorants sensibles

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Recherche

Neurosciences

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l&#39;aide d&#39;un pistolet à gènes modifiés

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Un grand latéral Craniotomie Procédure pour Mesoscale grand champ d&#39;imagerie optique de l&#39;activité cérébrale

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

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Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

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Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Enregistrement d&#39;EEG dans des rats néonatals à déplacement libre à l&#39;aide d&#39;une nouvelle méthode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

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Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...