Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT erhielt den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 und JP15K00413) von MEXT und Zuschüssen des Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] und H30 [18062156]). Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Englischsprachige Bearbeitung.

Alle Tierversuche wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee der Tokushima Bunri University genehmigt wurden. Das folgende Protokoll für die Slice-Vorbereitung ist fast eine Standardprozedur27 , aber die Modifikationen waren die Protokolle der Färbung und Aufzeichnung mit VSD.
1. Vorbereitung vor dem Tag des Experiments
<ol><li>Bereiten Sie die Lager A (Tabelle 1), Lager B (Tabelle 2), und Lager C (...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

Die Scheibenphysiologie ist entscheidend, um das richtige Signal zu sammeln. Die Verwendung des Ring-Membran-Filtersystems in diesem Protokoll stellt sicher, dass die Scheibe während des gesamten Verfahrens gesund und unverzerrtbleibt. Andere Systeme können verwendet werden, um die Schnittphysiologie während der Aufnahme beizubehalten, aber die Scheibe sollte zu keinem Zeitpunkt verformt werden, da die Bildgebung jeden Teil d...

Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD) Imaging of bulk-stained brain slice preparations has become a useful quantitative tool to assess the dynamics of neural circuits1,2,3,4 . Nach der Analyse der Veränderungen der optischen Eigenschaften durch Membrananregung5,6,7wurde DIE VSD-Bildgebung erstmals in den frühen 1970er Jahren von Cohen und anderen6,8, 9. ; es ist eine geeignete Methode, um die Gehirnfunktionen in Echtzeit zu überwachen, da der Farbstoff direkt die Membranpotentialveränderungen (d.h. das primäre Signal der Neuronen) untersucht.
Die frühesten VSDs besaßen die wünschenswerten Eigenschaften, um das Gehirnsystem zu verstehen, wie eine schnelle Zeitkonstante, um die schnelle Kinetik neuronaler Membranpotentialereignisse zu verfolgen, und Linearität mit der Veränderung des Membranpotentials9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Ähnlich wie bei anderen bildgebenden Experimenten erfordert diese Technik eine breite Palette spezifischer Abstimmungen, wie Kameras, Optik, Software und Slice-Physiologie, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund dieser technischen Fallstricke waren die erwarteten Vorteile bei den ersten Bemühungen für die meisten Laboratorien, die sich nicht auf diese Technik spezialisiert hatten, nicht unbedingt eingetreten.
Die Urursache der technischen Schwierigkeit war die geringe Empfindlichkeit des VSD gegenüber der Membranpotenzialänderung, wenn sie auf Diemassenfärbung von Scheibenpräparaten angewendet wurde. Die Größe des optischen Signals (d.h. die fraktionierte Veränderung der Fluoreszenz) beträgt in der Regel 10-4-10-3 des Steuersignals (F0) unter physiologischen Bedingungen. Die Zeitskala der Membranpotentialänderung in einem Neuron beträgt ungefähr Millisekunden bis wenige hundert Millisekunden. Um die Veränderungen des Membranpotenzials des Neurons zu messen, sollte die kamera, die für die Aufnahme verwendet wird, in der Lage sein, Bilder mit hoher Geschwindigkeit (10 kHz bis 100 Hz) zu erfassen. Die geringe Empfindlichkeit von VSD und die Geschwindigkeit, die benötigt wird, um dem neuronalen Signal zu folgen, erfordert eine große Menge an Licht, um an der Kamera mit hoher Geschwindigkeit gesammelt zu werden, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (S/N)2,16.
Die Optik des Aufzeichnungssystems ist auch ein entscheidendes Element, um die Erfassung von ausreichend Licht zu gewährleisten und S/N zu verbessern. Die von der Optik erreichte Vergrößerung ist oft zu niedrig, z. B. 1X bis 10X, um einen lokalen funktionellen neuronalen Schaltkreis zu visualisieren. Um beispielsweise die Dynamik des Hippocampus zu visualisieren, wäre eine Vergrößerung von etwa 5 geeignet. Eine solche geringe Vergrößerung hat eine geringe Fluoreszenzeffizienz; daher wäre eine fortschrittliche Optik für eine solche Aufnahme von Vorteil.
Darüber hinaus ist auch die Scheibenphysiologie von wesentlicher Bedeutung. Da die bildgebende Analyse erfordert, dass die Slices intakt sind, ist eine sorgfältige Schnittverarbeitung erforderlich17. Darüber hinaus sind Maßnahmen, die ergriffen werden, um die Realisierbarkeit der Scheibe für einen längeren Zeitpunkt zu erhalten, wichtig18.
Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von Scheiben, VSD-Färbung und Messungen. Der Artikel beschreibt auch die Verbesserungen der VSDs, des Bildgebungsgeräts und der Optik sowie andere zusätzliche Verfeinerungen des experimentellen Systems, die es ermöglicht haben, diese Methode als einfache, leistungsstarke und quantitative Assay zur Visualisierung der Veränderung der Gehirnfunktionen19,20,21,22,23,24,25. Die Technik kann auch weit verbreitet für langfristige Potenzierung im CA1-Bereich von Hippocampus-Scheiben1verwendet werden. Darüber hinaus ist diese Technik auch bei der optischen Erfassung von Membranpotentialen in einer einzelnen Nervenzelle26nützlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

Die Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD)-Bildgebung von Hirnscheibenpräparaten ist ein nützliches Werkzeug, um die funktionelle Konnektivität in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten. Aufgrund der bruchstückhaften Veränderung des Lichtsignals war es schwierig, diese Methode als quantitativen Test zu verwenden. Dieser Artikel beschreibt spezielle Optiken und Slice-Handling-Systeme, die diese Technik stabil und zuverlässig machen. Der vorliegende Artikel zeigt die Schnittbearbeitung, Färbung und Aufzeichnung der VSD-befleckten Hippocampusscheiben im Detail. Das System hält die physiologischen Bedingungen für eine lange Zeit, mit guter Färbung, und verhindert mechanische Bewegungen der Scheibe während der Aufnahmen. Darüber hinaus ermöglicht es die Färbung von Scheiben mit einer kleinen Menge des Farbstoffs. Die Optik erreicht eine hohe numerische Blende bei geringer Vergrößerung, die die Aufzeichnung des VSD-Signals bei einer maximalen Bildrate von 10 kHz mit einer räumlichen Auflösung von 100 Pixelx x 100 Pixel ermöglicht. Aufgrund der hohen Bildrate und räumlichen Auflösung ermöglicht diese Technik die Anwendung der Post-Recording-Filter, die ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, um die Veränderungen in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten.

Abbildung 5 zeigt das repräsentative optische Signal bei elektrischer Stimulation der Schaffer-Kollateralen im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe. Die aufeinanderfolgenden Bilder in Abbildung 5A zeigen das optische Signal, bevor räumliche und zeitliche Filter angewendet wurden, während Abbildung 5B die gleichen Daten nach dem Anwenden eines 5 x 5 x 5 Kubikfilters zeigt (eine Gaußsche Kerne...

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Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wir führen eine reproduzierbare und stabile optische Aufzeichnungsmethode für Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff ein. Der Artikel beschreibt spannungsempfindliche Farbstofffärbung und Aufzeichnung optischer Signale mit herkömmlichen Hippocampus-Scheibenpräparaten.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Die optische Aufnahmemethode mit spannungsempfindlichem Farbstoff gilt als ideale Technologie, um die Funktionsweise des Gehirns zu visualisieren. Diese Methode ermöglichte es uns, eine neuropsychische Dynamik stabil und zuverlässig über 12 Stunden aufzuzeichnen, da wir einen Blick auf die psychische Aktivität erhielten. Wir versuchen, die Anwendung zu erweitern, um Schaltungsänderungen zu erkennen, die durch Chemikalien auf der gesamten Entwicklungsstufe verursacht werden, wie z. B. wertvolle Säureanwendung bei Müttern.Die Technik ist bereits etabliert. Bitte versuchen Sie, Studien zu reproduzieren, indem Sie die hier vorgestellte Methode befolgen. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauchen Sie den enthaupteten Kopf in eiskalte ACSF in einem chirurgischen Tablett aus Edelstahl ein.Extrahieren Sie das Gehirn innerhalb einer Minute und legen Sie es in einem Becher mit gekühltem ACSF für fünf Minuten. Als nächstes teilen Sie den Gehirnabschnitt an der Mittellinie mit einem Skalpell und legen Sie beide Hemisphären auf einen 4%Agar-Block. Legen Sie dann den Hirnblock mit beiden Hemisphären auf einen 4%Agar-Block.Wischen Sie den überschüssigen ACSF mit einem Filterpapier aus dem Block. Anschließend Superkleber auf die Vibratome-Plattform auftragen. Legen Sie den Agarblock darauf und wischen Sie den übermäßigen Klebstoff mit einem Filterpapier ab.Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge eiskalten ACSF von der Oberseite des Gehirnagarblocks auf, um überschüssigen Superkleber zu festigen und zu verhindern, dass der Kleber das Gehirn bedeckt und das Schneiden stört. Befestigen Sie anschließend die Plattform am Vibramtablett und gießen Sie den modifizierten ACSF. Stellen Sie das Vibratom auf eine langsame Geschwindigkeit ein und haben Sie die Klingenfrequenz bei ihrer maximalen Einstellung.Dann beginnen Sie zu schneiden. Legen Sie die Scheiben in der Ecke der Scheibenkammer nacheinander, damit die Reihenfolge der Scheiben leicht unterschieden werden kann. Normalerweise können drei bis fünf Scheiben aus einer Hemisphäre gewonnen werden.Als nächstes schneiden Sie den Hirnstammteil mit einer 30-Meter-Nadel ab. Mit einem kleinen gekippten Pinsel die Scheibe auf den Membranfilter legen, der mit einem Plexiglasring gehalten wird. Legen Sie den Ring in eine feuchte Rückgewinnungskammer und sichern Sie die Abdeckung, um den Innendruck hoch zu halten.Wenn Sie die Scheibe auf den Membranfilter legen, passen Sie die Richtung und Position der Scheibe innerhalb des Rings an, um sicherzustellen, dass sie gut zentriert ist und eine konsistente Richtung hat. Lassen Sie die Probe bei 28 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für mindestens 10 bis 30 Minuten für die Erholung. Um die Scheiben zu färben, tragen Sie 100 Mikroliter der Färbelösung vorsichtig auf jede Scheibe auf und brüten bei 20 Minuten bei Raumtemperatur.Als nächstes bereiten Sie 50 bis 100 Milliliter ACSF in einem Behälter vor. Legen Sie den Ring mit der Probe darin, um die Färbelösung zu spülen. Dann übertragen Sie die vorgespülten Scheiben in eine andere Inkubationskammer.Warten Sie mehr als eine Stunde auf die Wiederherstellung vor dem Experiment. Um mit diesem Vorgang zu beginnen, schalten Sie den Verstärker, den Computer und das Kamerasystem ein, und öffnen Sie die Software. ACSF in ein 50-Milliliter-Rohr gießen und mit Carbogen blasen.Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um den ACSF zu zirkulieren und den Durchfluss auf etwa einen Milliliter pro Minute einzustellen. Passen Sie dann die Höhe der Saugpipette so an, dass der Flüssigkeitsstand in der Experimentierkammer immer konstant ist. Legen Sie die Masseelektrode in die Kammer.Anschließend die Glaselektrode mit einer kleinen Menge ACSF füllen und in den Elektrodenhalter legen. Befestigen Sie den Halter an der Stange des Manipulators. Achten Sie mit einem Verstärker darauf, dass der Elektrodenwiderstand etwa ein Megaohm beträgt.Übertragen Sie in der Aufnahmesitzung eine Scheibe aus der feuchten Kammer in eine Versuchskammer. Drücken Sie die Kante des Rings fest in den Silikon-O-Ring. Achten Sie darauf, die Membran oder den Boden der Experimentierkammer nicht zu brechen.Unter dem Mikroskop legen Sie die Spitze der stimulierenden Elektrode und die Feldpotential-Aufnahmeelektrode auf die Scheibe. Überprüfen Sie die evozierte Antwort, indem Sie einen Stimulus bereitstellen. Vergewissern Sie sich, dass das Sichtfeld den richtigen neuronalen Schaltkreis im optischen Aufzeichnungssystem abdeckt.Passen Sie als Nächstes die Anregungslichtintensität auf ca. 70 bis 80 % der maximalen Kapazität an der Kamera an. Passen Sie mit der Fluoreszenzlichtquelle den Fokus mit dem Erfassungssystem an. Starten Sie dann die Aufzeichnung und analysieren Sie die Daten in einer Bildaufnahmesoftware nach der Erfassung.Diese Abbildung zeigt das repräsentative optische Signal bei elektrischer Stimulation des Schaffer-Collaterols im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe. Diese aufeinanderfolgenden Bilder zeigen das optische Signal, bevor räumliche und zeitliche Filter angewendet wurden, während diese Bilder die gleichen Daten zeigen, nachdem sie zweimal einen fünf mal fünf kubischen Filter angewendet haben. Aufgrund der hohen Bildrate und der hohen räumlichen Auflösung änderte die Anwendung des Filters das Signal nicht, sondern filterte das Rauschen heraus, das auch im in Pixel aufgezeichneten Zeitverlauf in einer einzigen Versuchsstudie beobachtet werden kann.Hier ist der Vergleich der typischen Antworten im Bereich CA1 der Hippocampus-Scheiben zwischen Maus und Ratte. Die kleine hyperpolarisierende Reaktion wird in der distalen Seite des CA1 nach 24 Millisekunden in der Maus Hippocampus-Scheibe beobachtet, aber massivere hyperpolarisierende Reaktion überholt die depolarisierende Reaktion in der Ratte Hippocampal-Scheibe. Sobald die Scheiben gefärbt sind, sollten sie über 12 Stunden dauern und Sie können andere elektrophysiologische Aufnahmen auf ihnen durchführen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Forschung

Neurowissenschaften

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Aufzeichnung von EEG in frei bewegten neonatalen Ratten mit einer neuartigen Methode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...