Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TTは、JSPSカケンヒ助成金(JP16H06532、 文部科学省の助成金(厚生労働省「15570760」、H30[180626])のJP16K21743、JP16H06524、JP16K00038、JP15K00413。英語編集の編集(www.editage.jp)に感謝します。

全ての動物実験は、徳島文理大学動物管理利用委員会の承認を受けた議定書に従って行われました。スライス調製のための以下のプロトコルは、ほぼ標準的な手順27であるが、変更はVSDによる染色および記録のプロトコルであった。
1. 実験日の前の準備
<ol><li>ストックA(表1)、ストックB(表2)、ストックC(表3)溶液を?...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

スライス生理学は、正しい信号を収集するために不可欠です。このプロトコルでリング膜フィルタシステムを使用すると、手順2、16、17を通じてスライスが健全で歪まないままであることを保証します。他のシステムは、記録中にスライス生理学を保持するために使用することができますが、イメージングは、スライスの?...

バルク染色された脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路1、2、3、4のダイナミクスを評価するのに有用な定量的ツールとなっています。.膜励起5、6、7、VSDイメージングによる光学特性の変化の分析の後、コーエンらによって1970年代初頭に最初に説明された6,8、 9. ;染料が膜電位変化(すなわち、ニューロンの一次シグナル)を直接プローブするので、脳の機能をリアルタイムで監視するのに適した方法です。
最も初期のVSDは、神経膜電位事象の急速な運動性に従う速い時間定数、膜電位の変化との直線性など、脳システムを理解するために望ましい特性を有していた9、10歳,11歳,12歳,13歳,14歳,15.他のイメージング実験と同様に、この技術は、カメラ、光学、ソフトウェア、スライス生理学などの幅広い特定のチューニングを必要とし、所望の結果を達成する必要があります。これらの技術的な落とし穴のために、最初の努力の間に期待される利点は、必ずしもこの技術に特化していない研究室のほとんどのために実現しませんでした。
技術的な困難の主な原因は、スライス製剤のバルク染色に適用した場合の膜電位変化に対するVSDの低感度であった。光信号の大きさ(すなわち、蛍光の分画変化)は、通常、生理的条件下での対照(F0)信号の10-4-10-3である。ニューロンにおける膜電位変化の時間スケールは、約ミリ秒から数百ミリ秒です。ニューロンの膜電位の変化を測定するには、記録に使用されるカメラは、高速(10 kHz~100Hz)で画像を取得できる必要があります。VSDの低感度とニューラル信号に従うために必要な速度は、高い信号対雑音比(S/N)2、16で、高速でカメラに集める大量の光を必要とします。
記録システムの光学はまた十分な光のコレクションを保障し、S/Nを改善するために重要な要素である。光学系によって達成される倍率は、多くの場合、局所的な機能的な神経回路を可視化するために、1Xから10Xなど、過度に低いです。例えば、海馬回路のダイナミクスを可視化するためには、約5倍の倍率が適しているであろう。このような低倍率は、低蛍光効率を有する;したがって、高度な光学系は、このような記録のために有益であろう。
また、スライス生理学も不可欠です。イメージング解析ではスライスをそのままにする必要があるため、慎重なスライス処理が必要です17.さらに、スライスの生存率を長期間維持するための対策が重要である18.
本稿では、スライスの調製、VSD染色、および測定のためのプロトコルについて説明する。また、VSD、イメージングデバイス、光学系の改善、および実験システムに対するその他の改良点の概要を説明し、この方法を視覚化するための簡単で強力で定量的なアッセイとして使用することを可能にしました。脳機能の修飾19,20,21,22,23,24,25.この技術はまた、海馬スライス1のCA1領域における長期増強のために広く使用することができる。さらに、この技術は、単一の神経細胞26における膜電位の光学的記録にも有用である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路における機能的接続性を評価するのに有用なツールである。光信号の小数変化により、この方法を定量的アッセイとして用いるのは困難であった。この資料では、この技術を安定して信頼性の高い方法で行う特殊な光学およびスライス処理システムについて説明します。本稿では、VSD染色海馬スライスのスライス処理、染色、および記録について詳しく説明する。システムは良好な染色と長い時間の生理学的条件を維持し、記録の間にスライスの機械的な動きを防ぐ。また、少量の染料でスライスの染色が可能です。光学系は低倍率で高い数値絞りを実現し、100ピクセル×100ピクセルの空間解像度で最大フレームレート10kHzでVSD信号を記録できます。高いフレームレートと空間分解能により、この技術は、神経回路の変化を評価するのに十分な信号対雑音比を提供するポストレコーディングフィルタの適用を可能にします。

図5は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャッファー担保の電気刺激時の代表的な光信号を示す。図 5Aの連続した画像は、空間フィルタと時間フィルタが適用される前の光信号を示し、図 5Bは 5 x 5 x 5 立方フィルタ (ガウスカーネル畳み込み、5 x 5 空間- および 5 に対して 5 を適用した後の同じデ...

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Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

電圧感受性染料を用いた脳スライスの再現性と安定した光学記録法をご紹介します。この記事では、従来の海馬スライス製剤を用いた光信号の電圧感受性染料染色と記録について説明する。

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

感応色の光記録法は、脳の働き方を可視化する理想的な技術と考えられています。この方法は、精神的な活動に関する見解を与えられ、12時間以上にわたって神経精神動態を安定的かつ確実に記録することを可能にした。母に対する貴重な酸塗布など、開発全段階で化学物質による回路変化を検出するアプリケーションを拡大しようとしています。この技術はすでに十分に確立されています。ここで紹介する方法に従って、研究を再現してみてください。この手順を開始するには、切断された頭部を氷の冷たいACSFにステンレス鋼の外科用トレイに浸します。1分以内に脳を抽出し、5分間冷やしたACSFを含むビーカーに入れます。次に、メスで中線の脳部を分割し、4%寒天ブロックに両方の半球を配置します。次に、両半球の脳ブロックを4%寒天ブロックに置きます。余分な ACSF をフィルタ ペーパーでブロックから拭き取ります。その後、バイブレーションのプラットフォームにスーパーグルーを適用します。寒天ブロックを置き、過剰な接着剤を濾紙で拭きます。優しく余分なスーパーグルーを固め、接着剤が脳を覆い、スライスを乱すことを防ぐために、脳寒天ブロックの上から氷冷ACSFの少量を適用します。その後、プラットフォームをビブラートメトレーに固定し、変更されたACSFを注ぎます。ビブラートを低速に設定し、ブレード周波数を最大設定にします。その後、スライスを開始します。スライスの順序を簡単に区別できるように、スライスチャンバーの隅にスライスを順番に配置します。通常、1つの半球から3〜5枚のスライスを得ることができます。次に、30ゲージ針を用いて脳幹部分を切断する。小さな先端のペイントブラシを使用して、プレキシガラスリングで保持されている膜フィルターの上にスライスを置きます。リングを湿った回復室に置き、カバーを固定して内圧を高く保ちます。スライスを膜フィルターに配置する場合は、リング内のスライスの方向と位置を調整して、適切に中央に配置され、一貫した方向を持つようにします。標本を摂氏28度に30分間放置し、室温で少なくとも10~30分間放置して回収します。スライスを染色するには、各スライスに100マイクロリットルの染色液をそっと塗布し、室温で20分でインキュベートします。次に、50~100ミリリットルのACSFを容器に入れる。試料を入れたリングを入れ、染色液をすすきます。次に、すすったスライスを別のインキュベーションチャンバーに移します。実験の前に回復のために1時間以上待ちます。この手順を開始するには、アンプ、コンピュータ、カメラシステムの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。50ミリリットルのチューブにACSFを注ぎ、カルボーゲンで泡立て。ACSFを循環させ、流量を毎分約1ミリリットルに調整するために蠕動ポンプを使用してください。次に、実験室内部の液位が常に一定になるように吸引ピペットの高さを調整する。地面電極をチャンバーに置きます。続いて、ガラス電極に少量のACSFを充填し、電極ホルダーに入れます。ホルダをマニピュレータのロッドに取り付けます。アンプを使用して、電極抵抗がおよそ1メガオームであることを確認してください。録音セッションでは、湿ったチャンバから実験室にスライスを移します。リングの端をしっかりとシリコンOリングに押し込みます。膜や実験室の底部を壊さないように注意してください。顕微鏡下では、刺激電極の先端と電界電位記録電極をスライスに配置します。刺激を提供することによって、呼び起こされる応答を確認します。視野が光学記録システムの右の神経回路を覆っていることを確認します。次に、励起光強度をカメラの最大容量の約70~80%に調整します。蛍光光源を使用して、集録システムで焦点を調整します。そして、記録を開始し、取得後の画像取得ソフトウェアのデータを分析する。この図は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャファーコラテロールの電気刺激時の代表的な光信号を示す。これらの連続した画像は、任意の容量フィルタと時間フィルタが適用される前に光信号を示し、これらの画像は5/5〜5立方フィルタを2回適用した後、同じデータを示しています。高いフレームレートと高い空間分解能のために、フィルタの適用は信号を変更しませんでしたが、単一の試行でピクセルで記録された時間コースでも観察できるノイズを除外しました。ここでは、マウスとラットの海馬スライスの領域CA1の典型的な応答の比較です。小さな過分極応答は、マウス海馬スライスで24ミリ秒後にCA1の遠位側で観察されるが、より大規模な過分極応答はラット海馬スライスの脱分極応答を追い越した。スライスが染色されると、それらは12時間以上続く必要があり、あなたはそれらに他の電気生理学的録音を行うことができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

位置選択的微粒子銃は、改変された遺伝子銃を使用した器官型脳切片におけるターゲティング

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

新しい方法を用いた自由に動く新生児ラットの脳波記録

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...