Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 도쿠시마 분리 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 슬라이스 준비를 위한 다음 프로토콜은 거의 표준 절차 27이지만, 수정은 VSD로 염색 및 기록의 프로토콜이었다.
1. 실험일 전준비
<ol><li>재고 A (표1),재고 B (표2),및 재고 C (표3)솔루션을 준비하고 냉장고?...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을...

대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.
초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따르고, 멤브레인 전위 9의 변화와선형성 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15. 다른 이미징 실험과 유사하게,이 기술은 원하는 결과를 달성하기 위해 카메라, 광학, 소프트웨어 및 슬라이스 생리학과 같은 광범위한 특정 튜닝을 필요로합니다. 이러한 기술적 함정 으로 인해 초기 노력 중 예상되는 이점은이 기술을 전문으로하지 않은 대부분의 실험실에서 반드시 구체화되지는 않았습니다.
기술적 난이도의 원초적 원인은 슬라이스 제제의 대량 염색에 적용될 때 멤브레인 전위 변화에 대한 VSD의 낮은 민감도였다. 광 신호의 크기(즉, 형광의 분수 변화)는 일반적으로 생리적 조건하에서 대조군(F0) 신호의 10-4-10-3이다. 뉴런의 막 전위 변화의 시간 척도는 약 밀리초에서 수백 밀리초까지입니다. 뉴런의 멤브레인 전위 변화를 측정하기 위해 레코딩에 사용되는 카메라는 고속(10kHz ~ 100Hz)의 이미지를 획득할 수 있어야 합니다. VSD의 낮은 감도와 신경 신호를 따르는 데 필요한 속도는 높은 신호 대 잡음 비 (S / N)2,16으로고속으로 카메라에서 많은 양의 빛을 수집해야합니다.
레코딩 시스템의 광학 장치는 충분한 빛의 수집을 보장하고 S/N을 개선하는 데 중요한 요소입니다. 광학에 의해 달성된 배율은 종종 국소 기능신경회로를 가시화하기 위해 1X ~ 10X와 같이 지나치게 낮습니다. 예를 들어, 해마 회로의 역학을 시각화하기 위해 약 5의 배율이 적합할 것입니다. 이러한 낮은 배율은 낮은 형광 효율을 가지고; 따라서 고급 광학은 이러한 기록에 도움이 될 것입니다.
또한 슬라이스 생리학도 필수적입니다. 이미징 분석에는 슬라이스가 손상되지 않도록 해야 하므로17. 또한, 더 긴 시간 동안 슬라이스 생존을 유지하기 위해 취한 조치는 중요하다18.
이 문서에서는 슬라이스, VSD 염색 및 측정을 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 또한 VSD, 이미징 장치 및 광학에 대한 개선 사항 및 이 방법을 간단하고 강력하며 정량적 분석으로 사용할 수 있게 한 실험 시스템에 대한 기타 추가 개선 사항에 대해 설명합니다. 뇌 기능의 수정19,20,21,22,23,24,25. 이 기술은 또한 해마 슬라이스1의CA1 영역에서 장기 적인 약식에 널리 사용될 수 있다. 더욱이, 이 기술은 단일 신경 세포(26)에서막 전위(26)의 광학 기록에도 유용하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.

도 5는 마우스 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 샤퍼 담보의 전기 자극 시 대표적인 광 신호를 나타낸다. 그림 5A의 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 표시하는 반면, 그림 5B는 5 x 5 x 5 입방 필터(가우시안 커널 컨볼루션, 5 x 5 공간- 및 5)를 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니?...

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Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

전압 에 민감한 염료를 가진 광학 기록 방법은 두뇌가 어떻게 작동하는지 시각화하는 이상적인 기술로 생각됩니다. 이 방법을 통해 우리는 12 시간 동안 안정적으로 신경 역학을 기록 할 수 있었습니다. 우리는 어머니에게 귀중한 산 응용 프로그램과 같은 개발의 모든 단계에서 화학 물질로 인한 회로 변화를 감지하기 위해 응용 프로그램을 확장하려고합니다.이 기술은 이미 잘 확립되어 있습니다. 여기에 제시된 방법을 따라 연구를 재현해 보십시오. 이 절차를 시작하려면, 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 참수 머리를 몰입.1 분 이내에 뇌를 추출하고 5 분 동안 차가운 ACSF를 포함하는 비커에 놓습니다. 다음으로, 메스와 미드 라인의 뇌 섹션을 분할하고 4 %의 천 블록에 두 반구를 배치합니다. 그런 다음 두 반구가 있는 뇌 블록을 4%의 한천 블록에 놓습니다.필터 용지로 블록에서 초과 ACSF를 닦아냅니다. 그 후 진동 플랫폼에 슈퍼 접착제를 적용합니다. 한천 블록을 위에 놓고 필터 용지로 과도한 접착제를 닦아냅니다.뇌 천 블록 상단에서 소량의 얼음 차가운 ACSF를 부드럽게 적용하여 과도한 초접착제를 고화시키고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하지 않도록 합니다. 그 후, 진동 트레이에 플랫폼을 수정하고 수정 된 ACSF를 부어. 진동을 느린 속도로 설정하고 블레이드 주파수를 최대 설정으로 설정합니다.그런 다음 슬라이스를 시작합니다. 슬라이스 챔버의 순서를 쉽게 구별할 수 있도록 슬라이스 챔버의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치합니다. 일반적으로 3~5개의 슬라이스는 한 반구에서 얻을 수 있다.다음으로, 30 게이지 바늘을 사용하여 뇌 줄기 부분을 잘라. 작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시글라스 링으로 유지되는 멤브레인 필터에 슬라이스를 놓습니다. 고리를 습한 복구 챔버에 놓고 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다.슬라이스를 멤브레인 필터에 배치할 때 링 내의 슬라이스의 방향과 위치를 조정하여 잘 중심이 되고 일관된 방향을 갖습니다. 표본을 섭씨 28도에서 30분 간 방치한 다음 실온에서 회복을 위해 최소 10~30분 간 둡니다. 슬라이스를 염색하려면 스테인링 솔루션 100마이크로리터를 각 슬라이스에 부드럽게 바르고 실온을 위해 20분 만에 배양합니다.다음으로 컨테이너에 50~100밀리리터의 ACSF를 준비합니다. 얼룩액을 헹구기 위해 시편과 링을 놓습니다. 그런 다음 헹도 된 조각을 다른 인큐베이션 챔버로 옮기습니다.실험 전에 복구를 위해 1시간 이상 기다립니다. 이 절차를 시작하려면 앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어를 엽니다. 50 밀리리터 튜브에 ACSF를 붓고 카보겐으로 거품을 냅니다.연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시키고 유량을 분당 약 1밀리리터로 조정합니다. 그런 다음, 실험 챔버 내부의 액체 수준이 항상 일정하게 되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다. 접지 전극을 챔버에 놓습니다.그 후, 소량의 ACSF로 유리 전극을 채우고 전극 홀더에 놓습니다. 홀더를 조작자의 막대에 부착합니다. 앰프를 사용하여 전극 저항이 약 1 메가옴인지 확인합니다.레코딩 세션에서, 습한 챔버에서 실험 챔버로 슬라이스를 전송한다. 링 의 가장자리를 실리콘 o 링에 단단히 누릅니다. 실험 챔버의 막 이나 바닥을 부러 뜨리지 않도록주의하십시오.현미경의 밑에 자극전극의 끝과 필드 잠재적 기록 전극을 슬라이스에 놓습니다. 자극을 제공하여 호출된 응답을 확인합니다. 시야가 광학 기록 시스템의 오른쪽 신경 회로를 커버하는지 확인합니다.다음으로, 카메라의 최대 용량의 약 70~80%로 흥분광 강도를 조정합니다. 형광광원을 사용하여 획득 시스템으로 초점을 조정합니다. 그런 다음 수집 후 이미지 수집 소프트웨어에서 레코딩을 시작하고 데이터를 분석합니다.이 그림은 마우스 해마 슬라이스의 영역 CA1에서 샤퍼 콜라탈롤의 전기 자극시 대표적인 광학 신호를 나타낸다. 이러한 연속 이미지는 간격 및 측두엽 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 나타내며, 이러한 이미지는 5x 5 입방 필터를 두 번 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 높은 프레임 속도와 높은 공간 해상도로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않았지만 단일 평가판에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서 관찰할 수 있는 노이즈를 필터링했습니다.다음은 마우스와 쥐 사이의 해마 슬라이스의 영역 CA1의 전형적인 반응의 비교입니다. 작은 과극 반응은 마우스 해마 슬라이스에서 24 밀리초 후에 CA1의 단상 측에서 관찰되지만, 더 거대한 과극화 반응은 쥐 해마 슬라이스에서 탈극반응을 추월했다. 슬라이스가 염색되면 12 시간 이상 지속되어야하며 다른 전기 생리학적 기록을 수행 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

연구

신경과학

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

위치 선택성과 유전자는 수정 된 유전자 총을 사용의 Organotypic 뇌 조각에 타겟팅

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

새로운 방법으로 자유롭게 움직이는 신생아 쥐의 뇌파 기록

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...