Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT mottok JSP KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskudd fra helse-, arbeids-og Velferdsdepartementet (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering.

Alle dyr eksperimenter ble utført i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og use Committee of Tokushima Bunri University. Følgende protokoll for klargjøring av sektor er nesten en standard prosedyre27 , men endringene har vært protokollene for farging og innspilling med VSD.
1. forberedelse før dagen av eksperimentet
<ol><li>Klargjør lager A (tabell 1), lager B (tabell 2) og lager C (tabell 3) løsning...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

Stykket fysiologi er avgjørende for å samle riktig signal. Bruken av ring membran filtersystemet i denne protokollen sikrer at stykket forblir sunt og un-forvrengt gjennom prosedyren2,16,17. Andre systemer kan brukes til å beholde skive fysiologi under innspillingen, men stykket bør ikke bli deformert til enhver tid som tenkelig behov hver eneste del av stykket for å være sunn. Det ring-membran filtersystemet er også bedr...

Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (vsd) tenkelig av bulk-flekkete hjerne skive forberedelser har bli en nyttig kvantitative verktøyet å vurdere dynamikken i neural kretser1,2,3,4 . Etter analysen av endringene i optiske egenskaper på grunn av membran eksitasjon5,6,7, VSD Imaging ble først beskrevet i begynnelsen av 1970-tallet av Cohen ogandre 6,8, 9.; Det er en egnet metode for å overvåke hjernens funksjoner i sanntid som fargestoff direkte sonder membranen potensielle endringer (dvs. den primære signal av neurons).
De tidligste VSDs hadde den ønskelige egenskaper for å forstå hjernens system, slik som en rask tid-konstant å følge den raske Kinetics av neuronal membran potensielle hendelser, og linearitet med endring i membran potensial9, 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15. ligner på andre Imaging eksperimenter, krever denne teknikken et bredt spekter av spesifikke stemming, slik som kameraer, optikk, programvare, og skive fysiologi, for å oppnå de ønskede resultater. På grunn av disse tekniske fallgruvene, de forventede fordelene ved første innsats ikke nødvendigvis materialisere for de fleste laboratorier som ikke er spesialister på denne teknikken.
Den primal årsaken til den tekniske problemer var lav følsomhet i VSD mot membranen potensielle endringen når den brukes til bulk farging av Slice forberedelser. Størrelsen på det optiske signalet (dvs. brøk endringen i fluorescens) er vanligvis 10-4-10-3 av kontrollen (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskala av membran potensiell endring i en Nevron er ca millisekunder til noen hundrevis av millisekunder. For å måle endringer i membranen potensialet i Nevron, kameraet brukes for innspillingen skal kunne erverve bilder med høy hastighet (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomheten til VSD og hastigheten som trengs for å følge det nevrale signalet krever en stor mengde lys som skal samles på kameraet i høy hastighet, med et høyt signal-til-støy-forhold (S/N)2,16.
Optikk av opptaks systemet er også et kritisk element for å sikre innsamling av tilstrekkelig lys og for å forbedre S/N. Forstørrelsen oppnås ved optikk er ofte overdrevent lav, for eksempel 1X til 10X, for å visualisere en lokal funksjonell nevrale krets. For eksempel, for å visualisere dynamikken i hippocampus krets, en forstørrelse på ca 5 ville være egnet. Slike lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor vil avansert optikk være gunstig for slike opptak.
I tillegg er stykket fysiologi også viktig. Siden Imaging analyse krever skiver for å være intakt, forsiktig skive håndtering er nødvendig17. Videre er tiltak tatt for å opprettholde skive levedyktighet for en lengre tid er viktig18.
Denne artikkelen beskriver protokollen for utarbeidelse av skiver, VSD farging og målinger. Artikkelen skisserer også forbedringer til VSDs, tenkelig enhet og optikk, og andre ytterligere forbedringer til det eksperimentelle systemet som har aktivert denne metoden skal brukes som en grei, kraftig og kvantitativ analysen for å visualisere modifikasjon av hjernensfunksjoner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også bli mye brukt for langsiktige potensiering i CA1 området av hippocampus skiver1. Videre er denne teknikken også nyttig i optisk innspilling av membran potensialer i en enkelt nerve celle26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (VSD) tenkelig av hjerne skive forberedelser er en nyttig verktøyet å vurdere det funksjonell connectivity inne neural kretsløpene. På grunn av brøk endring i lyssignalet, har det vært vanskelig å bruke denne metoden som en kvantitativ analysen. Denne artikkelen beskriver spesielle optikk og Slice håndtering systemer, som gjør denne teknikken stabil og pålitelig. Denne artikkelen demonstrerer stykket håndtering, farging, og innspillingen av VSD-beiset hippocampus skiver i detalj. Systemet opprettholder fysiologiske forhold i lang tid, med gode flekker, og hindrer mekaniske bevegelser av stykket under opptakene. Videre gjør det farging av skiver med en liten mengde av fargestoff. Optikk oppnå høy numerisk blenderåpning ved lav forstørrelse, noe som gjør opptak av VSD signal ved maksimal bildefrekvens på 10 kHz, med 100 piksel x 100-piksel romlig oppløsning. På grunn av høy bildefrekvens og romlig oppløsning, tillater denne teknikken anvendelse av post-innspillingen filtre som gir tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for å vurdere endringer i nevrale kretser.

Figur 5 viser den representative optiske signal ved elektrisk stimulering av Schaffer sikkerhet i området CA1 av en mus hippocampus skive. De påfølgende bildene i figur 5a viser det optiske signalet før eventuelle romlige og timelige filtre ble brukt, mens figur 5B viser de samme dataene etter å ha brukt et 5 x 5 x 5 kubikk filter (en Gaussian kernel convolution, 5 x 5 romlig-og 5 til Temporal-d...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Vi introduserer en reproduserbar og stabil optisk opptaks metode for hjerne skiver ved hjelp av spennings følsomt fargestoff. Artikkelen beskriver spennings følsomme fargestoff flekker og opptak av optiske signaler ved hjelp av konvensjonelle hippocampus Slice forberedelser.

Bred-åker enkelt-Foton optisk innspillingen inne hjerne skive benytter Voltage-følsom Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Den optiske opptaksmetoden med spenningsfølsom fargestoff antas å være en ideell teknologi for å visualisere hvordan hjernen fungerer. Denne metoden tillot oss å registrere en nevropsykisk dynamikk stabilt og pålitelig over 12 timer, gitt oss et syn på psykisk aktivitet. Vi prøver å utvide programmet for å oppdage kretsendringer forårsaket av kjemikalier på alle utviklingsstadier, for eksempel verdifull syreapplikasjon til mødre.Teknikken er allerede godt etablert. Prøv å reprodusere studier ved å følge metoden som presenteres her. For å starte denne prosedyren, dypp det halshuggede hodet i iskald ACSF i et kirurgisk brett i rustfritt stål.Trekk ut hjernen innen ett minutt og legg den i et beger som inneholder kjølt ACSF i fem minutter. Deretter deler du hjerneseksjonen midt i med en skalpell og plasserer begge halvkuler på en 4% agarblokk. Deretter plasserer du hjerneblokken med begge halvkuler på en 4% agarblokk.Tørk av overflødig ACSF fra blokken med et filterpapir. Deretter gjelder superlim på vibratomplattformen. Plasser agarblokken på den og tørk av det for høye limet med et filterpapir.Påfør forsiktig en liten mengde iskald ACSF fra toppen av hjernen agar blokk for å bidra til å stivne overflødig superlim og for å hindre limet fra å dekke hjernen og forstyrre kutting. Etterpå kan du feste plattformen til vibratomskuffen og helle den modifiserte ACSF. Sett vibratomen til en langsom hastighet og ha bladfrekvensen ved maksimal innstilling.Så begynn å kutte. Plasser skivene i hjørnet av skivekammeret i rekkefølge slik at rekkefølgen på skivene lett kan skilles. Vanligvis kan tre til fem skiver fås fra en halvkule.Klipp deretter av hjernestammedelen ved hjelp av en 30 gauge nål. Bruk en liten tippet pensel til å plassere skiven på membranfilteret som holdes med en plexiglassring. Plasser ringen i et fuktig gjenopprettingskammer og fest dekselet for å holde det indre trykket høyt.Når du plasserer skiven på membranfilteret, justerer du retningen og posisjonen til skiven i ringen for å sikre at den er godt sentrert og har en konsekvent retning. La prøven stå ved 28 grader Celsius i 30 minutter og deretter ved romtemperatur i minst 10 til 30 minutter for gjenoppretting. For å flekke skivene, påfør forsiktig 100 mikroliter av fargeoppløsningen på hver skive og inkubere etter 20 minutter for romtemperatur.Deretter forbereder du 50 til 100 milliliter ACSF i en beholder. Plasser ringen med prøven i den for å skylle fargeløsningen. Deretter overfører du de skyllede skivene til et annet inkubasjonskammer.Vent mer enn en time for utvinning før eksperimentet. For å starte denne prosedyren, slå på forsterkeren, datamaskinen og kamerasystemet og åpne programvaren. Hell ACSF i et 50 milliliter rør og boble det med karbaogen.Bruk en peristaltisk pumpe til å sirkulere ACSF og justere strømningshastigheten til omtrent én milliliter per minutt. Juster deretter høyden på sugepipetten slik at væskenivået inne i eksperimentkammeret alltid er konstant. Plasser jordelektroden i kammeret.Fyll deretter glasselektroden med en liten mengde ACSF og legg den i elektrodeholderen. Fest holderen til stangen på manipulatoren. Bruk en forsterker, sørg for at elektrodemotstanden er omtrent en megaohm.I innspillingsøkten overfører du et stykke fra det fuktige kammeret til et eksperimentelt kammer. Trykk kanten av ringen godt inn i silikon-ringen. Vær forsiktig så du ikke bryter membranen eller bunnen av eksperimentkammeret.Under mikroskopet plasserer spissen av den stimulerende elektroden og feltpotensialet opptakselektroden på skiven. Sjekk den fremkalte responsen ved å levere en stimulans. Bekreft at synsfeltet dekker høyre nevrale krets i det optiske opptakssystemet.Deretter justerer du eksitasjonslysintensiteten til omtrent 70 til 80 % av maksimal kapasitet ved kameraet. Juster fokuset med oppkjøpssystemet ved hjelp av den fluorescerende lyskilden. Deretter starter du opptaket og analyserer dataene i en bildeanskaffelsesprogramvare etter oppkjøpet.Denne figuren viser det representative optiske signalet ved elektrisk stimulering av Schaffer-kollaterol i området CA1 av en mus hippocampal skive. Disse påfølgende bildene viser det optiske signalet før noen spacial og temporale filtre ble brukt mens disse bildene viser de samme dataene etter å ha brukt et fem og fem med fem kubikkfilter to ganger. På grunn av høy bildefrekvens og høy romlig oppløsning endret ikke anvendelsen av filteret signalet, men filtrerte ut støyen som også kan observeres i tidsforløpet som er registrert i piksler i en enkelt studie.Her er sammenligningen av de typiske svarene i området CA1 av hippocampal skiver mellom mus og rotte. Den lille hyperpolariserende responsen observeres på den distale siden av CA1 etter 24 millisekunder i musen hippocampal skive, men mer massiv hyperpolariserende respons overtok depolariserende responsen i rotte hippocampal skive. Når skivene er farget, bør de vare i over 12 timer, og du kan utføre andre elektrofysiologiske opptak på dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spenning-sensitive Dye Opptak fra Axoner, dendritter og dendrittiske spines av enkelte nerveceller i hjernen skiver

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Targeting i organotypic Brain Slices Ved hjelp av en modifisert Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

En stor sideveis kraniotomi Prosedyre for mesoskala Wide-field Optical Imaging av hjernens aktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Utarbeidelse av akutt hjernen skiver med en optimalisert N-Methyl-D-glucamine beskyttende gjenopprettingsmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Registrering av EEG i fritt bevegelige neonatale rotter ved hjelp av en ny metode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Opptak og modulering Epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver koplet til Microelectrode matriser

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...