Name: wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

TT mottog JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 och JP15K00413) från MEXT och bidrag från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] och H30 [18062156]). Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelsk språkiga redigering.

Alla djur försök utfördes enligt protokoll som godkänts av djur omsorgs-och användnings kommittén vid Tokushima bunri University. Följande protokoll för segment beredning är nästan en standard procedur27 , men ändringarna har varit protokoll för färgning och inspelning med VSD.
1. förberedelser inför dagen för experiment
<ol><li>Förbered beståndet A (tabell 1), lager B (tabell 2) och lager C (tabell 3</strong...

<ol>
	<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation.">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li><li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes.">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence,+turbidity,+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation.">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li><li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity.">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li><li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opacity+changes+in+stimulated+nerve.">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li><li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential.">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).</li><li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System.">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li><li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity.">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential.">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li><li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon.">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li><li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue,+cell,+and+model+membrane+preparations.">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li><li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System.">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li><li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus.">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li><li>Tominaga, T., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+apparatus+for+sliced+specimen+of+biological+tissue+and+specimen+holder.">Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder.</a> US Patent. , (2002).</li><li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li><li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau.">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li><li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation.">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li><li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory.">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li><li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid.">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li><li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro:+network+dynamics,+filter+properties,+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP.">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).</li><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+(LTP)+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging.">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).</li><li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices.">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).</li><li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+recording+from+axons,+dendrites+and+dendritic+spines+of+individual+neurons+in+brain+slices.">Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices.">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function.">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li><li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders:+Excitation/Inhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories.">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).</li><li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebalancing+Altered+Computations:+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum.">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li><li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer&#8217;s+disease.">Impairments of neural circuit function in Alzheimer&#8217;s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).</li><li>Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits.">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2++imaging+of+neuronal+circuit+activity.">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li></ol>

Segmentfysiologi är avgörande för att samla in rätt signal. Användningen av ring membran filter systemet i detta protokoll säkerställer att segmentet förblir friskt och oförvrängt under hela proceduren2,16,17. Andra system kan användas för att behålla segmentfysiologi under inspelningen, men segmentet bör inte få deformeras när som helst eftersom bilden behöver varje del av segmentet för att vara felfri. Ring-m...

Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av bulk-betsad Brain slice preparat har blivit ett användbart kvantitativt verktyg för att bedöma dynamiken i neurala kretsar1,2,3,4 . Efter analysen av förändringar i optiska egenskaper på grund av membran excitation5,6,7, VSD Imaging beskrevs första gången i början av 1970-talet av Cohen och andra6,8, 9.; Det är en lämplig metod för att övervaka hjärnans funktioner i real tid som färg ämne direkt sonder membranet potentiella förändringar (dvs, den primära signalen för nerv celler).
De tidigaste VSDs besatt önskvärda egenskaper för att förstå hjärnans system, såsom en snabb tid-konstant att följa den snabba kinetiken av neuronala membran potentiella händelser, och linearitet med förändringen i membranet potential9, 10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14 (på) , 15. liknar andra Imaging experiment, kräver denna teknik ett brett spektrum av specifika stämningar, såsom kameror, optik, program vara och slice fysiologi, för att uppnå önskat resultat. På grund av dessa tekniska fall gro par, de förväntade fördelarna under de första insatserna inte nödvändigt vis materialisera för de flesta av de laboratorier som inte specialiserade på denna teknik.
Den primala orsaken till den tekniska svårigheten var den låga känsligheten hos VSD mot membranet potentiell förändring när den tillämpas på bulk färgning av slice preparat. Storleken på den optiska signalen (dvs. fraktionerad förändring i fluorescens) är vanligt vis 10-4-10-3 av Control (F0) signal under fysiologiska förhållanden. Tids skalan för membranpotential förändring i en neuron är cirka millisekunder till några hundra millisekunder. För att mäta förändringar i neuronpotentialen i neuron, bör kameran som används för inspelningen kunna förvärva bilder med hög hastighet (10 kHz till 100 Hz). Den låga känsligheten hos VSD och den hastighet som krävs för att följa den neurala signalen kräver en stor mängd ljus som ska samlas på kameran med hög hastighet, med ett högt signal-brus-förhållande (S/N)2,16.
Optiken i inspelnings systemet är också en kritisk faktor för att säkerställa insamling av tillräckligt ljus och för att förbättra S/N. Förstoringen uppnås av optiken är ofta överdrivet låg, såsom 1X till 10X, för att visualisera en lokal funktionell neurala kretsen. Till exempel, för att visualisera dynamiken i hippocampus kretsen, en förstoring av cirka 5 skulle vara lämplig. Sådan låg förstoring har låg fluorescens effektivitet; Därför skulle Avancerad optik vara fördelaktigt för sådan inspelning.
Dessutom är segmentfysiologi också viktigt. Eftersom bild analysen kräver att skivorna är intakta behövs noggrann segment hantering17. Dessutom är de åtgärder som vidtagits för att bibehålla segmentets lönsamhet under en längre tid viktiga18.
I den här artikeln beskrivs protokollet för beredning av skivor, VSD-färgning och mätningar. Artikeln beskriver också förbättringar av VSDs, Imaging Device, och optik, och andra ytterligare förfiningar till det experimentella systemet som har möjliggjort denna metod som skall användas som en enkel, kraftfull och kvantitativ analys för att visualisera modifiering av hjärnans funktioner19,20,21,22,23,24,25. Tekniken kan också användas i stor utsträckning för långsiktig potentiering i CA1 området av Hippocampus skivor1. Dessutom är denna teknik också användbar i optisk inspelning av membran potentialer i en enda nervcell26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:940px;" width="942">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">High speed image acquisition system</td>
			<td style="width:195px;">Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">MiCAM - Ultima</td>
			<td style="width:171px;">Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High speed image acquisition system</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>MiCAM 02</td>
			<td>Imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Macroscepe for wide field imaging</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>THT macroscope</td>
			<td>macroscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td style="width:353px;">LEX-2G</td>
			<td style="width:171px;">LED illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image acquisition software</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>BV-ana</td>
			<td>image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifunctional electric stimulator</td>
			<td>Brainvision co. Ltd.</td>
			<td>ESTM-8</td>
			<td>Stimulus isolator+AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1200S</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000</td>
			<td>slicer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blade for slicer</td>
			<td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>#99027</td>
			<td>carbon steel razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Membrane filter for slice support</td>
			<td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td>
			<td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &#181;m pores,</td>
			<td>membrane filter/ 0.45 13</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Numerical analysis software</td>
			<td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td>
			<td>IgorPro</td>
			<td>analysing software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stimulation isolator</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>A395</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>AD/DA converter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>catalog number: D-1199</td>
			<td>VSD: Di-4-ANEPPS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poloxamer</td>
			<td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Pluronic F-127 P30000MP</td>
			<td>poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">polyethoxylated castor oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cremophor EL C5135</td>
			<td>polyethoxylated castor oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field single-photon optical recording in brain slices using voltage-sensitive dye

Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av hjärnan slice preparat är ett användbart verktyg för att bedöma den funktionella anslutningen i neurala kretsar. På grund av den fraktionerad förändring i ljus signalen, har det varit svårt att använda denna metod som en kvantitativ analys. Den här artikeln beskriver speciella optik och segment hanterings system, som gör denna teknik stabil och pålitlig. Den nuvarande artikeln visar slice hantering, färgning och inspelning av VSD-färgade Hippocampus skivor i detalj. Systemet upprätthåller fysiologiska förhållanden under lång tid, med bra färgning, och förhindrar mekaniska rörelser av segmentet under inspelningarna. Dessutom, det möjliggör färgning av skivor med en liten mängd av färg ämnet. Optiken uppnår hög numerisk bländare vid låg förstoring, vilket möjliggör inspelning av VSD-signalen vid maximal bild hastighet på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumslig upplösning. På grund av den höga bild hastighet och rumslig upplösning, denna teknik tillåter tillämpning av post-inspelningsfilter som ger tillräcklig signal-brus-förhållande för att bedöma förändringar i neurala kretsar.

Figur 5 visar den representativa optiska signalen vid elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter i område CA1 av en mus Hippocampus skiva. De på varandra följande bilderna i figur 5a visar den optiska signalen innan några rumsliga och temporala filter tillämpades, medan Figur 5b visar samma data efter applicering av ett 5 x 5 x 5 Kubikfilter (en Gaussian kernel-faltning, 5 x 5 spatial-och 5 t...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye at JoVE.com

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Vi introducerar en reproducerbar och stabil optisk inspelnings metod för hjärn skivor med spännings känsligt färg ämne. Artikeln beskriver spännings känslig färg färgning och inspelning av optiska signaler med hjälp av konventionella Hippocampus slice preparat.

Wide-fält Single-Photon optisk inspelning i hjärn skivor använda spännings känsliga Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Den optiska registreringsmetoden med spänningskänsligt färgämne tros vara en idealisk teknik för att visualisera hur hjärnan fungerar. Denna metod tillät oss att spela in en neuropsykisk dynamik stabilt och tillförlitligt över 12 timmar, gett oss en syn på psykisk aktivitet. Vi försöker att expandera ansökan för att upptäcka kretsförändringar orsakade av kemikalier på alla utvecklingsstadium, såsom värdefull syra ansökan till mödrar.Tekniken är redan väl etablerad. Försök att återge studier genom att följa den metod som presenteras här. Till att börja detta förfarande, sänk ned det halshuggna huvudet i iskall ACSF i en rostfritt stål kirurgisk bricka.Extrahera hjärnan inom en minut och placera den i en bägare som innehåller kyld ACSF i fem minuter. Därefter dela hjärnan avsnitt vid mittlinjen med en skalpell och placera båda halvkloten på en 4%agar block. Placera sedan hjärnblocket med båda halvkloten på ett 4%agarblock.Torka av överskottet ACSF från blocket med ett filterpapper. Därefter applicera superlim på vibratomplattformen. Placera agarblocket på den och torka av det överdrivna limmet med ett filterpapper.Applicera försiktigt en liten mängd iskall ACSF från toppen av hjärnans agarblock för att hjälpa till att stelna överskott superlim och för att förhindra att limmet täcker hjärnan och stör skivningen. Efteråt, fixera plattformen till vibratome facket och häll den modifierade ACSF. Ställ in vibratomen på en långsam hastighet och ha klingfrekvensen vid sin maximala inställning.Börja skivning då. Placera skivorna i hörnet av segmentkammaren i en följd så att ordningen på segmenten lätt kan särskiljas. Vanligtvis tre till fem skivor kan erhållas från en halvklot.Därefter skär av hjärnstammen delen med hjälp av en 30 gauge nål. Med hjälp av en liten tippad färgborste, placera skiva på membranfiltret hålls med en plexiglas ring. Placera ringen i en fuktig återhämtningskammare och säkra locket för att hålla det inre trycket högt.När du placerar skivan på membranfiltret, justera riktning och position av skiva inom ringen för att säkerställa att den är väl centrerad och har en konsekvent riktning. Låt exemplaret vara på 28 grader Celsius i 30 minuter och sedan i rumstemperatur i minst 10 till 30 minuter för återhämtning. För att färga skivorna, applicera försiktigt 100 mikroliter av färgningslösningen på varje skiva och inkubera i 20 minuter för rumstemperatur.Därefter förbereder du 50 till 100 milliliter ACSF i en behållare. Placera ringen med preparatet i den för att skölja färgningslösningen. Sedan överför du de sköljda skivorna till en annan inkubationskammare.Vänta mer än en timme för återhämtning före experimentet. Till att börja med den här proceduren slår du på förstärkaren, datorn och kamerasystemet och öppnar programvaran. Häll ACSF i ett 50 milliliter rör och bubbla den med carbogen.Använd en peristaltisk pump för att cirkulera ACSF och justera flödet till ungefär en milliliter per minut. Justera sedan höjden på sugpipetten så att vätskenivån inuti experimentkammaren alltid är konstant. Placera jordelektroden i kammaren.Därefter fyller glaselektroden med en liten mängd ACSF och placerar den i elektrodhållaren. Fäst hållaren i manipulatorns stav. Med hjälp av en förstärkare, se till att elektrodmotståndet är ungefär en megaohm.I inspelningssessionen överför du en skiva från den fuktiga kammaren till en experimentell kammare. Tryck in ringens kant ordentligt i silikon o-ringen. Var försiktig så att du inte bryter membranet eller botten av experimentkammaren.Under mikroskopet placera spetsen av den stimulerande elektroden och fältet potentiella inspelning elektrod på skiva. Kontrollera framkallat svar genom att leverera en stimulans. Bekräfta att synfältet täcker den högra nervkretsen i det optiska inspelningssystemet.Därefter justerar du excitationsljusintensiteten till ungefär 70 till 80 %av den maximala kapaciteten vid kameran. Med hjälp av den fluorescerande ljuskällan justerar du fokus med förvärvssystemet. Sedan, starta inspelningen och analysera data i en bild förvärv programvara efter förvärvet.Denna figur visar den representativa optiska signalen vid elektrisk stimulering av Schaffer collaterol i området CA1 av en mus hippocampus skiva. Dessa på varandra följande bilder visar den optiska signalen innan någon spacial och temporala filter tillämpades medan dessa bilder visar samma data efter att ha tillämpat en fem med fem av fem kubikfilter två gånger. På grund av den höga bildhastigheten och hög rumslig upplösning ändrade inte filtrets tillämpning på signalen, utan filtrerade bort bullret som också kan observeras i den tidskurs som registrerats i pixlar i en enda prövning.Här är jämförelsen av de typiska svaren i området CA1 av hippocampus skivor mellan mus och råtta. Den lilla hyperpolariserande svar observeras i den distala sidan av CA1 efter 24 millisekunder i musen hippocampus skiva, men mer massiva hyperpolariserande svar gick om depolarizing svar i råtta hippocampus skiva. När skivorna är färgas, bör de pågå i över 12 timmar och du kan utföra andra elektrofysiologiska inspelningar på dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Optisk avbildning av nervceller i Crab Stomatogastric Ganglion med spänningskänsliga Färgämnen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spänningskänsliga Dye Inspelning från axoner, dendriter och Dendritutskotten av enskilda nervceller i hjärnan skivor

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektiv Biolistic Inriktning i Organotypic Brain skivor med hjälp av en modifierad Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ett stort Lateral Kraniotomi Förfarande för Mesoskalig Wide-field optisk avbildning av hjärnans aktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad N-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Inspelning EEG i fritt rörliga neonatala råttor med hjälp av en ny metod

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Inspelning och modulering av Epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor kopplat till mikroelektrod matriser

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...