Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
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这份手稿得到了 nihms08123321 (至 n. l.) 和弗吉尼亚大学麻醉学系的资助。作者们要感谢弗吉尼亚州夏洛特斯维尔弗吉尼亚大学生物系在 TEM 方面提供的出色培训和技术援助, 以及她对手稿的宝贵批评。作者们还感谢弗吉尼亚大学的先进电子显微镜设施在标本切片和染色后提供的技术援助。

所有研究都得到了弗吉尼亚大学 (弗吉尼亚州夏洛特斯维尔) 动物护理和使用机构委员会的批准, 并按照国家卫生研究院的准则进行。
1. 血管灌注固定
请注意:本杂志13已详细介绍了大鼠脑血管灌注的方法, 超出了本方案的范围。然而, 以下步骤是专门为准备新生大鼠脑组织, 以获得高质量的电子显微镜定量分析突触前端子突触囊...

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	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain:+a+quantitative+electron+microscopy+study.">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li><li>Akert, K., Sandri, C., Santini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+the+Maillet+method+for+cytochemical+studies+of+synapses.">Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses.</a> Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+of+synapses:+selective+staining+for+electron+microscopy.">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid.">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li><li>Burry, R. W., Lasher, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy.">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074 (1968).</li><li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranyl+acetate,+a+stain+and+a+fixative.">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li><li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides.">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li><li>Shah, D. 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Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

在 TEM 标本制备过程中处理组织切片需要相当程度的技巧、注意力和耐心。当使用微移液器添加和去除溶液时, 可以通过表面张力将样品吸进移液器尖端, 因此应非常小心, 以避免移液器对组织造成损伤。此外, 脱水顺序的某些步骤可以快速达 1分钟, 因此操作人员需要快速工作, 以确保下一个脱水步骤按时开始, 并且样品不会干燥或起皱。需要特别注意的一个程序是与的固定后。经过处理后, 截面变?...

我们描述了制备新生大鼠脑组织以获得高质量电子显微镜的方法, 以便深入分析神经末端1,2的突触囊空间分布。通过这些方法处理样品可以获得的高对比度显微图也可以用来研究一些细胞成分的详细形态及其尺寸结构关系 3,4。
透射电子显微镜 (TEM) 是定量研究细胞器和其他细胞结构形态的有力工具。截至本十年, 除了高压冷冻冷冻冷冻固定外, 没有其他研究方法能够在没有免疫标记的情况下提供相同程度的脂质膜和细胞器的分辨率。然而, 冷冻替代技术并没有得到广泛使用, 通常需要昂贵的设备和较长的准备时间。
为了利用 TEM 的高分辨能力, 优化样品制备至关重要。标本制备的主要目标是保持组织结构, 使其与活状态发生最小的变化, 增强标本对比度, 并在加工和接触电子的过程中稳定组织对提取细胞成分的影响梁。多年来, 多个实验室推出并完善了许多 TEM 组织制备方案。他们中的许多人都专注于突触囊5、6、7、8、9、10、11的最佳可视化方法。在目前使用的一些成熟的金标准方法中, 我们选择了化学固定、固定后、整体染色、顺序脱水、树脂包埋和染色后的程序, 目的是保持最佳的组织结构和实现出色的图像对比度。值得注意的是, 在处理新生大鼠脑组织时, 保持良好的超微结构尤其具有挑战性。事实上, 非常幼小的动物的中枢神经系统的特点是含水量高于成人大脑, 细胞外空间的扩大更加突出, 细胞12细胞之间的连接更加松散。这使得新生大鼠脑组织对渗透率的变化非常敏感, 在通过不同色调的连续溶液处理时, 更容易发生人工收缩和肿胀.因此, 我们的方法采用了尽可能接近大鼠新生大脑的渗透性的标本处理解决方案。我们的目标是获得高质量的高分辨率电子显微镜图像, 用于神经末端突触囊泡空间分布的定量评估。具体而言, 我们试图测量神经末端的囊泡的数量、突触囊与突触前质膜的距离、固定在突触前膜上的囊泡的数量、突触泡的大小以及囊间距离 1。
满意的化学内固定是获得高质量电子显微镜的先决条件, 这些显微图像可以为研究突触囊形态和空间组织提供必要的形态学细节。虽然存在多种固定方式, 但血管灌注固定脑组织明显优于其他方法。由于通过血管灌注固定在全身循环停止后立即开始, 它缩短了脑组织脱氧和蛋白质与固定物交联之间的间隔, 导致细胞的最小改变结构。此外, 它完成快速和均匀的渗透, 因为固定剂从血管床快速流动到细胞外和细胞隔间12,13,14。初级戊二醛固定, 其次是四氧化铬的二次固定 (后固定), 使细结构保存良好 15,16,17。戊二醛和甲醛的混合物具有更快速渗透到组织中的额外优势12。
由于生物组织不够刚性, 无法在没有树脂基体支撑的情况下切割成薄片, 因此在薄片之前, 需要将其嵌入介质中。水不混溶环氧树脂在透射电镜中常用作嵌入介质。当使用这种类型的基质时, 在树脂渗透之前, 必须用有机溶剂代替所有样品的游离水。通过一系列乙醇和/或丙酮浓度上升的溶液将水通过一系列溶液将样品取出.在这个协议中, 标本首先是平面嵌入之间灵活的丙烯酸片, 然后嵌入在胶囊。最终的结果是组织位于圆柱形树脂块的尖端, 它具有理想的几何形状, 受微细胞切片过程中产生的振动的影响最小。
用重金属染色以增强内源性组织对比度是标本制备的另一个重要方面。透射电镜中的图像对比度是由于组织中的原子的电子散射造成的。然而, 生物材料主要由低原子量分子 (即碳、氢、氧和氮) 组成。因此, 产生足够的散射对比度需要将高原子量原子加入到组织的细胞成分中。这是通过用重金属染色12,18,19来实现的。四氧化二铵、铀和铅与脂质结合强烈, 是最常见的用作电子污渍的重金属。
( 原子序数 76 ) 是现存密度最高的金属之一。它既是固剂, 也是污渍, 尽管它在 TEM 中的主要作用是可靠的固定剂12。在使用的各种固定方案中, 戊二醛后的双固定方法是减少标本制备过程中细胞成分提取的最有效方法。这两种固定剂用于稳定不同类型分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂质, 并导致组织超微结构的高级保存12,14, 15,16,17岁
铀 (原子序数 92) 是用作电子染色的最重的金属, 最典型的形式是醋酸铀。与铬类似, 它起到染色和固定剂的作用, 尽管它在 tem 中的主要作用是作为染色 20,21。含核酸和膜结构在醛固定组织 22,23 中被铀醇盐强烈和优先染色。在渗透后和脱水前使用醋酸铀对组织进行治疗, 可以稳定膜质和含核酸结构, 并增强对比度, 从而能够识别一些不需要识别的结构细节。仅在12、24、25染色的标本中就能很容易地检测到。据认为, 醋酸铀可以稳定精细结构, 结合减少铬已沉积在脂质膜在渗透24。当在嵌入前应用醋酸铀时, 并作为薄部分12中的染色后, 可实现最大对比度。
铅 (原子序数 82) 是透射电镜中最常见的染色, 主要用于薄片染色后。铅盐具有较高的电子不透明度, 并显示出广泛的细胞结构亲和力, 包括细胞膜, 核和细胞质蛋白,核酸和糖原 26, 27。当采用双重染色方法 (即用醋酸铀染色后, 用铅处理), 后者作为醋酸铀染色的显影剂。例如, 用戊二醛固定的染色质染色后, 醋酸铀的吸收增加了 3倍 28,29,30,31, 32.铅还能增强其他金属 (如铬) 的染色能力。据认为, 铅盐染色膜的渗透银固定组织通过附加到极性组的磷脂在减少的铬33存在.使用醋酸铀和铅染色的一个潜在缺点, 特别是在长时间内, 是许多不同的结构元素被均匀和非具体地染色, 因此可能不容易与彼此区分 12.
最近引入的替代光源, 如光学超分辨率光激活定位显微镜, 显著提高了光学显微镜分辨率 34。然而, 由于光学显微镜依靠组织化学和免疫细胞化学方法来可视化单个标记的蛋白质或酶, TEM 同时显示所有结构元素的能力仍然是无与伦比的, 无法深入研究组织结构的形态和维度关系。特别是, 没有其他技术可以提供必要的形态学细节, 以执行形态分析突触囊分布在突触前神经布腾。然而, 重要的是要注意的是, 电子显微镜捕捉组织的结构后, 生物体死亡, 因此, 他们不能提供有关的动态突触前囊泡贩运和细胞增多的信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态和功能方面时, 应考虑其他工具, 如 FM 染料活成像和膜片钳电生理学。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

我们的实验室和其他许多实验室利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究突触囊泡的形态和空间组织。为了获得高质量的电子显微镜, 从而获得对突触前囊泡分布进行定量分析所需的形态学细节程度, 最佳样品制备至关重要。化学固定是标本制备过程中的第一步, 对保持精细的超微结构至关重要。采用戊二醛-甲醛溶液固定血管, 然后用四氧化铬处理振动原子切片标本, 稳定分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂类, 并取得优异的保护效果超微结构。然后用反染色、连续脱水和树脂包埋法对组织进行处理。在样品加工过程中, 用醋酸铀进行整体染色 (即在树脂包埋前对振荡器切片组织进行染色) 增强了内源性对比, 并稳定细胞成分的提取。通过将醋酸铀作为超薄切片上的染色后, 可以进一步增加对比度。醋酸铀处理后, 用柠檬酸铅双染色超薄切片, 通过选择性结合醋酸铀增强含核酸结构的电子不透明度, 提高图像分辨率。透射电子显微镜是一个强大的工具, 用于表征突触囊的形态细节, 并量化其大小和空间组织在终端 bouton。然而, 由于它使用固定组织, 透射电子显微镜只能提供有关生命或进化过程的间接信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态或功能方面时, 应考虑其他技术。

已确定了主要被接受为表示 TEM 样品保存令人满意或有缺陷的一般标准。这些标准在四个选定的电子显微镜 (两个最佳制备例子, 两个有缺陷的制备例子) 中得到了通过按照本协议所述的方法治疗年轻的大鼠脑组织。
一般来说, 高质量的电子显微镜显示为有序、清晰和整体的灰度图像。在令人满意的样品中, 膜之间的空间应充满颗粒状材料, 并且不应该是空的。同样, 在细胞质地?...

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Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率的电子显微镜的程序, 以进行神经末端突触囊分布的形态分析。用这些方法获得的显微图像也可用于研究许多其他细胞成分的形态及其尺寸结构关系。

新生大鼠脑组织在神经端子突形圆锥花序分布超微结构形态分析中的制备

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

在用于传输电子显微镜组织准备的几种现有方案中，我们选择了产生最佳结构保存和高分辨率显微图的方法，对突触囊泡在预突触终端分布进行形态分析。通过这些方法获得的高对比度图像允许量化参数，如突触囊泡距离与预突触膜数量的囊泡停靠在预突触膜和囊泡间距离。所有这些参数都指示突触功能。由于突触囊泡的空间组织的变化可能与突触功能的破坏有关，这些方法已用于检查一般麻醉剂对突触发育的影响。这些方法还可用于检查任何药物或治疗对突触的详细形态的影响，以提供洞察其功能。首先准备三氧化二氮的骨质，用于通过血管灌注修复以前用甲状甲醛和谷胱甘肽固定的大鼠脑部分的固定后。使用三氧化硅治疗后，部分变得刚性。因此，组织处理需要关注从那时起。此外，在添加 osmium 之前，请确保您的部分被平展，因为任何褶皱都可能导致组织骨折。打开一个五毫升的玻璃安培4%的三氧化硅和水，并滴在棕色玻璃瓶中。加入5毫升0.2摩尔磷酸盐缓冲液，然后再添加10毫升0.1摩尔磷酸盐缓冲液，实现1%的最终溶液。使用装有长针的 20 毫升注射器，将 1%的三氧化二氮抽出，然后将三氧化二氮加入用铝箔覆盖的棕色玻璃罐中。在确保试样已展开并扁平化后，在试样小瓶中加入 1%的三氧化钛和 0.1 摩尔 PB。在室温下将样品孵育为三氧化硅一小时。孵育完成后，用微管提取三氧化硅，并如协议所述冲洗部分。要准备醋酸兰醇，请将含有100毫升70%乙醇的200毫升体积玻璃瓶放在搅拌板上。在烧瓶中加入四克醋酸兰基，包裹铝箔，防止光线沉淀，并持续搅拌。在50%乙醇中脱水部分。用准备好的4%醋酸碱染色一小时，然后按照手稿中所述连续脱水和冲洗。从 60 毫升盖夫奇注射器中取出注射器柱塞，用安全针盖住它。将注射器与开放侧向上放置，并一个地添加树脂混合物的每个成分。通过添加 525 微升 DMP30 与移液器完成。由于 DMP 非常粘稠，因此移液管的柱塞移动非常缓慢。将柱塞放回注射器中。反转注射器几次以混合内容物。颜色将从黄色更改为琥珀色。疏散注射器内的空气。然后放在摇杆上，持续摇晃至少 30 分钟。将一卷环氧树脂和一卷丙酮加入闪烁小瓶中，然后摇动混合。将这一树脂涂抹在组织部分的丙酮混合物上，最后一次丙酮冲洗后，保持覆盖，以避免丙酮蒸发。两到四个小时后，将树脂和丙酮的混合物取出，用全树脂代替，孵育四小时。将所有树脂废物放入收集容器中，进行聚合，并在以后处理。切两块透明聚氯氟乙烯薄膜的矩形片，然后用70%乙醇擦拭。修剪它们，使部分的每一侧至少有 1.5 厘米的无组织塑料，确保它们具有相同的宽度，但顶部的纸张高度大约是底片的 2/3。慢慢倾斜小瓶，使用细骆驼画笔和灵活的微铲非常轻轻地从底部抬起标本。然后小心地沿小瓶壁移动该部分，并转移到底部 PCTFE 纸张上。用微铲去除多余的树脂，用顶片轻轻盖住试样。轻轻推出任何被困的气泡，无需将直接压力施加到组织部分，并清除多余的树脂。使用耐溶剂笔为板材贴上标签，并在 60 摄氏度的烤箱中放置两到三天进行聚合。轻轻拉开夹心的 PCTFE 纸张以打开它们。使用耐溶剂笔标记板材的侧面，该侧面包含标记组织附近的粘附部分。使用圆盘冲孔获取部分的圆样，确保笔标记是冲孔组织中的一部分。当光在标本上闪耀时，笔标会闪闪发光。将嵌入胶囊的盖侧放在胶囊支架上。将一滴树脂放在盖子上，并将冲孔盘插入盖内，组织部分朝上。使用柔和的螺丝钉运动将胶囊插入盖子。使用精细的钳子将打印的两厘米长的纸标签卷入胶囊中，确保它符合胶囊侧壁的曲率。将嵌入树脂倒入胶囊内，填充到胶囊边缘，并使用尖木棒将组织标本向下推至底部。将胶囊在60摄氏度的烤箱中放入两到三天进行聚合。然后继续像协议中描述的那样进行分节和染色。神经细胞结构的令人满意的保存的电子显微图显示分层细胞膜没有断裂。细胞质是最终粒度，没有空白。线粒体既不肿胀也不收缩与保守的外双膜和完整的内部克里斯塔。神经元超结构和精细形态细节的最佳保存对于可视化突触囊泡并测量它们与预突触膜的距离至关重要。突触囊泡应不同，由不间断的单膜衬里。为了便于对突触囊泡分布进行形态分析，前突触膜和后突触膜的连续性应平行于其保持。组织结构缺陷保存的电子显微图显示神经元细胞膜的变形和破损，以及明显扩大的细胞外空间的存在。线粒体出现扩张，有肿胀的克里斯塔。在另一个有缺陷的组织结构保存的例子中，细胞质内有较大的白色空白空间，代替细粒度细胞质物质，并扩大细胞外空间。一种人造膜，很可能是由于在谷胱甘肽固定过程中调动脂质造成的。当工作年轻的脑组织使用1摩尔磷酸盐缓冲液作为溶剂，你所有的解决方案，使保持补品尽可能接近新生大鼠大脑，并尽量减少人工组织收缩和或肿胀。通过这些方法获得的显微图可用于研究突触囊泡以外的许多细胞成分的详细形态和维度结构关系。例如，线粒体、高尔吉仪器和核染色质。该协议中的几个步骤要求化学品具有毒性。处理醛、铀、铀和铅化合物时，始终在烟罩下工作并穿戴个人防护装备。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

科研

神经科学

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

低聚β-淀粉样蛋白的制备 1-42和突触可塑性损伤诱导海马脑片

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation从啮齿动物脑切片的神经元，研究突触传递和图像突触前的码头

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

使用调频染料培养的小脑颗粒神经突触小泡池补充的定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

膜片钳电容测量和Ca 2 +单神经末梢成像在视网膜切片

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

视网膜节的形态分析

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

高分辨率定量免疫膜受体在视网膜带状突触分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

在脑核糖凝视与原子力显微镜

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

分析突触调制<em&gt;果蝇</em&gt;曝光时间延长后，光光感受器

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...