Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Este manuscrito foi apoiado por NIH/NIGMS K08 123321 (para a) e por fundos do departamento de Anestesiologia da Universidade da Virgínia. Os autores desejam agradecer a alev Erisir (departamento de biologia, Universidade da Virgínia, Charlottesville, VA) por excelente treinamento e assistência técnica com a TEM, e por sua inestimável crítica manuscrita. Os autores igualmente agradecem a facilidade avançada da microscopia de elétron na Universidade de Virgínia para a assistência técnica com seccionamento do espécime e borne-mancha.

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Virginia (Charlottesville, VA) e conduzidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde.
1. fixação por perfusão vascular
Nota: Uma descrição geral do método de perfusão vascular cerebral de ratos já foi detalhada nesta revista13 e está além do escopo deste protocolo. No entanto, as etapas a s...

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	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. 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Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

A manipulação de seções do tecido durante a preparação do espécime para o TEM exige um grau considerável de finesse, de concentração e de paciência. Ao usar uma micropipeta para adicionar e remover soluções, os espécimes podem ser sugados na ponta da pipeta pela tensão de superfície, tão grande cuidado deve ser tomado para evitar dano de tecido pela pipeta. Também, determinadas etapas da seqüência da desidratação podem ser tão rápidas quanto 1 minuto, daqui o operador precisa de trabalhar rapidame...

Nós descrevemos métodos para a preparação do tecido de cérebro recém-nascido do rato para obter micrografias de elétron de alta qualidade para a Análise morfométrica detalhada da distribuição espacial do vesícula sináptica em terminais do nervo1,2. As micrografias de alto contraste que podem ser obtidas pelo processamento de espécimes seguindo esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia detalhada de um número de componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais3,4.
O microscópio eletrônico de transmissão (TEM) é uma ferramenta poderosa para estudar a morfologia das organelas e outras estruturas celulares quantitativamente. A partir desta década, não existem outros métodos de investigação que podem fornecer o mesmo grau de resolução de membranas lipídicas e organelas sem imuno-tagging, com exceção da criofixação por congelamento de alta pressão. No entanto, as técnicas de substituição de congelamento não são amplamente utilizadas, e normalmente exigem equipamentos caros e longos tempos de preparação.
A fim de aproveitar o alto poder de resolução do TEM, a preparação ideal do espécime é de suma importância. Os principais objetivos da preparação de amostras são preservar a estrutura do tecido com alteração mínima do estado de vida, aumentar o contraste da amostra e estabilizar o tecido contra a extração de componentes celulares durante o processamento e a exposição ao elétron Feixe. Numerosos protocolos para a preparação do tecido tem foram introduzidos e aperfeiçoados por vários laboratórios ao longo dos anos. Muitos deles se concentraram em métodos para visualização ideal de vesículas sinápticas5,6,7,8,9,10,11. Entre um número de métodos bem estabelecidos, padrão do ouro atualmente em uso, nós escolhemos procedimentos para a fixação química, a fixação do borne, a mancha do en Bloc, a desidratação seqüencial, a incorporação da resina e a mancha do borne que visam preservar a estrutura óptima do tecido e alcançar excelente contraste de imagem. Da nota, a preservação do ultraestrutura fino pode ser particularmente desafiante ao trabalhar com tecido recém-nascido do cérebro do rato. De fato, o sistema nervoso central de animais muito jovens caracteriza-se por um maior teor de água do que o cérebro adulto, ampliação mais proeminente dos espaços extracelulares e conexões mais soltas entre as células12. Isto faz o tecido de cérebro recém-nascido do rato profundamente sensível às mudanças na osmolaridade, e requintadamente propenso ao encolhimento vesícula e/ou ao inchamento quando processado com as soluções seqüenciais da tonicidade diferente12. Conseqüentemente, nossos métodos empregaram soluções para o processamento do espécime que são da osmolaridade tão perto como possível àquele do cérebro recém-nascido do rato. Nosso objetivo foi obter imagens de alta qualidade de microscopia eletrônica de alta resolução para avaliação quantitativa da distribuição espacial das vesículas sinápticas nos terminais nervosos. Especificamente, procurou-se medir o número de vesículas dentro do terminal nervoso, a distância das vesículas sinápticas da membrana plasmática pré-sináptica, o número de vesículas ancoradas na membrana pré-sináptica, o tamanho das vesículas sinápticas e a distâncias inter-vesicle1.
A fixação química satisfatória é um pré-requisito para a obtenção de micrografias de elétrons de alta qualidade que podem fornecer os detalhes morfológicos necessários para estudar a morfologia da vesícula sináptica e a organização espacial. Embora vários modos de fixação existam, a fixação do tecido cerebral por perfusão vascular é decididamente superior a outros métodos. Uma vez que a fixação via perfusão vascular começa imediatamente após a detenção da circulação sistêmica, encurta o intervalo entre a Desoxigenação do tecido cerebral e a reticulação de proteínas com fixadores, resultando em alterações mínimas na célula Estrutura. Além disso, realiza penetração rápida e uniforme, por causa do rápido fluxo do fixador do leito vascular para os compartimentos extracelulares e celulares12,13,14. A fixação primária com glutaraldeído, seguida de fixação secundária (pós-fixação) com tetroxida de ósmio, produz excelente preservação da estrutura fina15,16,17. Uma mistura de glutaraldeído e paraformaldeído tem a vantagem adicional de uma penetração mais rápida no tecido12.
Uma vez que os tecidos biológicos não são suficientemente rígidos para serem cortados em secções finas sem o apoio de uma matriz de resina, precisam de ser incorporados num meio antes de seccionamento fino. Resinas epóxi immiscible de água são comumente usadas como um meio de incorporação em TEM. Quando este tipo de matriz é usado, toda a água livre do espécime deve ser substituída com um solvente orgânico antes da infiltração da resina. A água é removida passando a amostra através de uma série de soluções de concentrações ascendentes de etanol e/ou acetona12. Neste protocolo, os espécimes são primeiro plano incorporado entre folhas ACLAR flexíveis, em seguida, incorporado em uma cápsula. O resultado final é o tecido situado na ponta de um bloco de resina cilíndrica, que tem a geometria ideal para ser menos afetada por vibrações que surgem durante o corte de micrótomo.
Manchar com metais pesados para realçar o contraste endógeno do tecido é um outro aspecto importante da preparação do espécime. O contraste da imagem em TEM é devido à dispersão do elétron pelos átomos no tecido. No entanto, materiais biológicos consistem em grande parte de moléculas de baixo peso atômico (i.e., carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio). Portanto, a geração de contraste de espalhamento suficiente requer a incorporação de átomos de alto peso atômico nos componentes celulares do tecido. Isso é conseguido através da coloração do espécime com metais pesados12,18,19. O tetroxide do ósmio, o urânio e a ligação, que ligam fortemente aos lipídios, são os metais pesados os mais comuns usados como manchas do elétron.
Ósmio (número atômico 76) é um dos metais os mais mais densas na existência. É um fixador e uma mancha, embora seu papel preliminar em tem seja como um fixador de confiança12. Entre os vários protocolos de fixação em uso, o método de dupla fixação com glutaraldeído seguido de ósmio é o mais efetivo na redução da extração de constituintes celulares durante a preparação do espécime. Estes dois fixadores são usados para estabilizar o número máximo de tipos diferentes de moléculas, especial proteínas e lipídios, e resultam na preservação superior do ultraestrutura12,14,15do tecido, 16 anos de , a 17.
O urânio (número atômico 92) é o metal o mais pesado usado como a mancha do elétron, o mais tipicamente no formulário do acetato do uranilo. Similarmente ao ósmio, atua como uma mancha e fixative, embora seu papel preliminar no tem seja como uma mancha20,21. As estruturas contendo ácidos nucleicos e membranosos são fortemente e preferencialmente coradas com sais de uranilo em tecidos fixos de aldeído22,23. O tratamento de tecidos com acetato de uranilo após osmicação e antes da desidratação resulta em estabilização de estruturas contendo ácido membranoso e nucleico, bem como contraste melhorado, e permite a identificação de alguns detalhes estruturais que não ser facilmente detectado em espécimes corados com ósmio sozinho12,24,25. Pensa-se que o acetato de uranilo pode estabilizar a estrutura fina combinando com o ósmio reduzido que foi depositado em membranas do lipido durante o osmication24. O contraste máximo é conseguido quando o acetato do uranilo é aplicado antes de incorporar e como uma borne-mancha em seções finas12.
A ligação (número atômico 82) é a mancha a mais comum usada para o TEM e é empregada principalmente para a borne-mancha de seções finas. Os sais de chumbo têm alta opacidade de elétrons e mostram afinidade para uma ampla gama de estruturas celulares, incluindo membranas, proteínas nucleares e citoplasmáticas, ácidos nucleicos e glicogénio26,27. Quando o método de coloração dupla é empregado (ou seja, a coloração com acetato de uranilo é seguida pelo tratamento com chumbo), este último atua como um desenvolvedor de coloração acetato de uranilo. Por exemplo, o chumbo pós-coloração da cromatina fixada com glutaraldeído aumenta a captação de acetato de uranilo por um fator de três28,29,30,31,32. A ligação igualmente realça a mancha transmitida por outros metais tais como o ósmio. Pensa-se que os sais de chumbo mancham as membranas de tecidos fixos de ósmio, anexando ao grupo polar de fosfatides na presença de ósmio reduzido33. Uma desvantagem potencial da mancha com o acetato e a ligação do uranilo, especial para durações prolongadas, é que muitos elementos estruturais diferentes são manchados ingualmente e não-especificamente, e assim não podem fàcilmente ser distinguidos de um outro12 .
A introdução recente de fontes luminosas alternativas, tais como na microscopia foto-ativada óptica da localização da super-definição, melhorou significativamente a definição34da microscopia de luz. No entanto, como a microscopia de luz depende de métodos histoquímicos e imuno-citoquímicos para visualizar proteínas ou enzimas rotuladas individualmente, o poder do TEM para exibir todos os elementos estruturais ao mesmo tempo permanece insuperável para estudo aprofundado do morfologia e relações dimensionais de estruturas teciduais. Em particular, nenhuma outra técnica pode fornecer o detalhe morfológico necessário para executar a Análise morfométrica da distribuição de vesículas sinápticas em boutons pré-sinápticos do nervo. No entanto, é importante notar que as micrografias de elétrons capturam a estrutura do tecido após a morte do organismo e, portanto, não podem fornecer informações sobre a dinâmica do tráfico de vesículas pré-sinápticas e da exocitose. Assim, outras ferramentas, como a imagem de FM corante-Live e a eletrofisiologia de remendo-braçadeira, devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos e/ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

Nosso laboratório e muitos outros exploraram o alto poder de resolução da microscopia eletrônica de transmissão para estudar a morfologia e a organização espacial das vesículas sinápticas. A fim de obter micrografias de elétrons de alta qualidade que podem produzir o grau de detalhe morfológico necessário para a análise quantitativa da distribuição de vesículas pré-sinápticas, a preparação ideal do espécime é crítica. A fixação química é o primeiro passo no processo de preparação de amostras, e de extrema importância para preservar a ultraestrutura fina. A fixação vascular com uma solução de glutaraldeído-formaldeído, seguida pelo tratamento de espécimes seccionados com vibratoma com tetroxida de ósmio, estabiliza o número máximo de moléculas, especialmente proteínas e lipídios, e resulta em conservação superior de ultrastructure. O tecido é então processado com a contrcoloração, desidratação sequencial e incorporação de resina. A coloração do bloco de en com acetato de uranilo (isto é, coloração do tecido vibratome-seccionado antes da incorporação da resina) realça o contraste endógeno e estabiliza componentes da pilha de encontro à extração durante o processamento do espécime. O contraste pode ser aumentado ainda mais aplicando o acetato do uranilo como uma borne-mancha em seções ultrafinos. A coloração dupla de secções ultrafinos com citrato de chumbo após o tratamento com acetato de uranilo também melhora a resolução da imagem, intensificando a opacidade de elétrons de estruturas contendo ácidos nucleicos através de ligação seletiva de chumbo ao acetato de uranilo. A microscopia eletrônica de transmissão é uma ferramenta poderosa para caracterização dos detalhes morfológicos das vesículas sinápticas e quantificação de seu tamanho e organização espacial no Bouton terminal. No entanto, por usar tecido fixo, a microscopia eletrônica de transmissão só pode fornecer informações indiretas sobre os processos de vida ou evolução. Portanto, outras técnicas devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.

Os critérios gerais que são aceitados na maior parte como indicativos da preservação satisfatória ou defeituosa do espécime para o tem foram estabelecidos. Estes critérios são exemplificados em quatro micrografias de elétron selecionados (dois exemplos da preparação óptima, dois exemplos da preparação defeituosa) que foram obtidos tratando o tecido de cérebro novo do rato que segue os métodos descritos neste protocolo.
Em geral, uma micrografia eletrônica de boa qualidade apar...

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Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Entre vários protocolos existentes para preparação de tecidos para microscopia eletrônica de transmissão, selecionamos métodos que produzem preservação estrutural ideal e micrografos de alta resolução para realizar a análise morfósica da distribuição de vesículas sináptica em terminais pré-sinápticos. As imagens de alto contraste obtidas com esses métodos permitem quantificar parâmetros como distância de vesículas sinápticas do número de membrana pré-sináptica de vesículas ancoradas na membrana pré-sináptica e distâncias interéculas. Todos esses parâmetros são indicativos de função sináptica.Uma vez que alterações na organização espacial de vesículas sinápticas podem estar associadas à interrupção da função sináptica, esses métodos têm sido usados para examinar os efeitos dos anestésicos gerais no desenvolvimento sináptico. Esses métodos também poderiam ser usados para examinar os efeitos de qualquer droga ou tratamento sobre a morfologia detalhada das sinapses para fornecer insights sobre sua função. Comece preparando tetroxida de ósmio para pós fixação de seções cerebrais de ratos previamente fixadas com paraformaldeído e glutaraldeído via perfusão vascular.As seções ficam rígidas após o tratamento com tetroxida de ósmio. Portanto, o manuseio de tecidos requer atenção a partir de então. Além disso, antes de adicionar ósmio, certifique-se de que suas seções estão achatadas, pois qualquer dobra provavelmente resultará em fratura tecidual.Abra uma ampola de vidro de cinco mililitros de 4%de tetroxida de ósmio e água e solte-a dentro de uma garrafa de vidro marrom. Adicione cinco mililitros de tampão de fosfato molar de 0,2 e adicione 10 mililitros adicionais de tampão fosfato molar de 0,1 para alcançar uma solução final de 1%. Use uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha longa para elaborar o tetroxida de 1%osmium e, em seguida, adicione o tetroxida de ósmio a um frasco de vidro marrom coberto com papel alumínio.Depois de certificar-se de que a amostra foi desdobrada e achatada, adicione 1%de tetroxida de ósmio e 0,1 pb molar ao frasco de espécime. Incubar o espécime em tetroxida de ósmio por uma hora em temperatura ambiente. Extrair o tetroxida de ósmio com um micropipet após a incubação estiver concluída e enxaguar as seções conforme descrito no protocolo.Para preparar o acetato deuranyl, coloque um frasco de vidro volumoso de 200 mililitros contendo 100 mililitros de 70% de etanol em uma placa de agitação. Adicione quatro gramas de acetato de urílico ao frasco, enrole uma folha de alumínio para evitar a precipitação pela luz e mexa continuamente. Desidratar as seções em 50% de etanol.Mancha com o acetato de 4%de urano por uma hora e segue com desidratação serial e lavagem como descrito no manuscrito. Remova o êmbolo da seringa de uma seringa de 60 mililitros e tampe-a com uma agulha de segurança. Posicione a seringa com o lado aberto e adicione cada ingrediente da mistura de resina um a um.Finalize adicionando 525 microliters de DMP30 com uma pipeta. Mover o êmbolo da tubulação muito lentamente como DMP é muito viscoso. Coloque o êmbolo de volta na seringa.Inverta a seringa algumas vezes para misturar o conteúdo. A cor mudará de amarelo para âmbar. Evacuar o ar dentro da seringa.Em seguida, coloque-o em um roqueiro com agitação contínua por pelo menos 30 minutos. Adicione um volume de resina epóxi e um volume de acetona a um frasco de cintilação e agite para misturar. Aplique esta uma em uma resina na mistura de acetona na seção de tecido após a última enxágüe de acetona mantendo-se coberta para evitar a evaporação de acetona.Remova o de uma mistura de resina e acetona após duas a quatro horas e substitua-a por resina completa e incuba por quatro horas. Coloque todos os resíduos de resina em um recipiente de coleta sob o capô para polimerizar e ser descartado posteriormente. Corte duas peças retangulares de filme de policlorotrifluoroetileno claro e limpe-as com 70% de etanol.Apare-os para que haja pelo menos 1,5 centímetro de plástico sem tecido em todos os lados da seção, certificando-se de que eles têm a mesma largura, mas a altura da folha em cima é aproximadamente 2/3 da folha inferior. Incline lentamente o frasco e use um pincel de camelo fino e uma micro-espátula flexível para levantar suavemente o espécime do fundo. Em seguida, mova cuidadosamente a seção ao longo das paredes do frasco e transfira para a folha inferior PCTFE.Remova o excesso de resina com uma micro-espátula e cubra suavemente o espécime com a folha superior. Empurre suavemente todas as bolhas de ar presas sem aplicar pressão direta na seção tecidual e elimine o excesso de resina. Use uma caneta resistente ao solvente para rotular as folhas e coloque em um forno a 60 graus celsius durante dois a três dias para polimerizar.Retire delicadamente as folhas PCTFE sanduíches para abri-las. Use uma caneta resistente ao solvente para marcar o lado da folha que contém a seção de adesão que a marca perto do tecido. Use um soco de disco para obter uma amostra de círculo da seção certificando-se de que a marca da caneta faz parte do tecido perfurado.A marca da caneta brilhará quando a luz estiver brilhando no espécime. Coloque a tampa de uma cápsula de incorporação lado para cima em um suporte de cápsula. Coloque uma gota de resina na tampa e insira o disco perfurado dentro da tampa com a seção de tecido voltada para cima.Insira uma cápsula na tampa usando um movimento suave de saca-rolhas. Use pinças finas para enrolar e baixar um pedaço de papel impresso de dois centímetros de comprimento na cápsula, certificando-se de que ele se encaixa na curvatura das paredes laterais da cápsula. Despeje a resina de incorporação dentro da cápsula, encha até a borda da cápsula e use uma vara de madeira pontiaguda para empurrar o espécime de tecido até o fundo.Coloque a cápsula no forno a 60 graus celsius durante dois a três dias para polimerização. E então continuar com secção e coloração como descrito no protocolo. O micrografo eletrônico de preservação satisfatória da estrutura celular neuronal mostra membranas celulares em camadas sem rupturas.O citoplasma é finalmente granular e sem espaços vazios. Mitocôndrias não estão inchadas nem encolhidas com uma membrana dupla externa conservada e cristae interna intacta. A preservação ideal da ultraestrutura neuronal e dos detalhes morfológicos finos é essencial para visualizar vesículas sinapáticas e medir sua distância da membrana pré-sináptica.As vesículas sinápticas devem ser distintas e forradas por uma membrana única ininterrupta. Para facilitar a análise morfométrica da distribuição de vesículas sinápticas, as membranas pré-sinápticas e postsinásticas devem ser paralelas em sua continuidade preservada. O micrografo eletrônico de preservação defeituosa da estrutura tecidual mostra a distorção e quebra das membranas celulares neuronais e a presença de espaços extracelulares significativamente ampliados.Mitocôndrias parecem distendidas e têm cristae inchada. Em outro exemplo de preservação da estrutura tecidual defeituosa, havia grandes espaços vazios brancos dentro do citoplasma no lugar de substância citoplasmática finamente granular com espaços extracelulares ampliados. Uma membrana artificial como tudo provavelmente resultou da mobilização de lipídios durante a fixação com glutaraldeído.Ao trabalhar, o tecido cerebral jovem usa 1 tampão de fosfato molar como solvente para toda a sua solução para que você mantenha a tônica o mais próxima possível da cérebro de rato recém-nascido e minimize o encolhimento e ou inchaço do tecido artefactual. Os micrografos obtidos com esses métodos podem ser usados para estudar a morfologia detalhada e as relações estruturais dimensionais de uma série de componentes celulares que não sejam vesículas sinápticas. Por exemplo, mitocôndrias, aparelhos golgi e cromatina nuclear.Várias etapas deste protocolo requerem produtos químicos que podem ser tóxicos. Sempre trabalhe sob um capô de fumaça e use equipamentos de proteção individual ao manusear aldeídos, osmium, urânio e compostos de chumbo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Neurociência

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Análises morfométricas de secções da retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...