Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי כספי הפעלה מהמכללה למדעי החקלאות והחיים והמכללה למדעים ב-וירג טק. ט נתמכת על ידי תוכנית ג'ורג ' וושינגטון קארבר ב וירג טק.

כל ההליכים, כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי המכון הפוליטכני של וירג והמדינה אוניברסיטת מוסדיים טיפול בעלי חיים והשתמש הוועדה (IACUC).
1. איסוף וחיתוך של רקמת המוח מכרסם
הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מוחות המוח בשימוש עם הליכים שונים ...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

כאן, אנו להדגים שיטה יעילה לכמת שינויים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאט באמצעות תאים שונים subcellular באותה חיה. כיום, רוב הנסיונות למדידת שינויי הסלולר בפעילות של מערכת אוביקוויב-פרוטאסביט הוגבלה לתא אחד לכל מדגם, והתוצאה היא צורך לחזור על ניסויים. זה מוביל לעלויות משמעותיות ולאובדן חיי בעלי חיי?...

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין (UPS) היא רשת מורכבת של מבני חלבון מחוברים וליגסים השולטים בהשפלה של רוב החלבונים הקצרי-החיים בתאים1. במערכת זו, חלבונים מסומנים עבור השפלה או תהליכים סלולריים אחרים/גורלות על ידי משנה קטן אוביקוויב. חלבון היעד יכול לרכוש 1-7 אוביקוויב שינויים, אשר יכול לקשר יחד באחד 7 ליזין (K) אתרים (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63) או מתיונין N-טרמינל (M1; הידוע בשם ליניארי) ב אוביקווילין הקודם2. חלק מתגי polyubiquitin אלה הם ספציפיים להשפלה (K48)3, בעוד אחרים הם עצמאיים במידה רבה של תהליך השפלה חלבון (M1)4,5,6. כך, תהליך החלבון אוביקווינציה מורכב מאוד ואת היכולת לכמת שינויים תג polyubiquitin מסוים הוא קריטי בסופו של דבר להבין את התפקיד של שינוי נתון בתפקוד הסלולר. עוד מסבך את המחקר של מערכת זו, פרוטאסדום, שהוא מבנה קטליטי של UPS7, שניהם מואפים חלבונים אבל יכול גם להיות מעורב בתהליכים אחרים שאינם נגד הפרוטחרדה8,9. לא באופן מפתיע אז, מאז התגלית הראשונית שלה, הפעילות הרגילה אוביקוויב-פרוטאסאין מעורבים היווצרות זיכרון ארוך טווח ומגוון של מצבי מחלה, כולל הרבה נוירולוגי, נוירוניווניות ופסיכיאטרי הפרעות10,11. כתוצאה מכך, שיטות שיכולות ביעילות וביעילות לכמת UPS פעילות במוח הם קריטיים להבנת בסופו של דבר כיצד מערכת זו אינה מוסדרת במצבי מחלה ופיתוח בסופו של דבר אפשרויות טיפול מיקוד אוביקוויב ו/או . התפקוד הפרוטאלי
ישנם מספר סוגיות בתחום הפעילות אוביקוויטים-פרוטאסאין ברקמת המוח מחולדות ועכברים, שהם מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות לחקר הפונקציה UPS, כולל 1) המגוון של אוביקוויטים שינויים, ו 2) הפצה ו הוויסות הדיפרנציאלי של UPS מתפקד על פני תאים תת-סלולריים12,13,14. למשל, רבים של ההפגנות המוקדמות של הפונקציה אוביקוויב-פרוטאסאט במוח במהלך היווצרות הזיכרון השתמשו לוחות תא שלם והצביעו עליות הזמן התלויות הן אוביקוויציה חלבונים ופעילות פרוטסאין15, מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , 20. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי פעילות אוביקוויב-פרוטאסאין מגוונת באופן נרחב על פני תאים subcellular בתגובה ללמידה, עם עליות בו באזורים מסוימים ופוחתת באחרים, דפוס שונה באופן משמעותי ממה שדווח בעבר בתא שלם21. זה תואם את המגבלה של גישה שלמה התא, כפי שהוא אינו יכול לנתק את התרומה של שינויים בפעילות ה-UPS על פני תאים משניים שונים. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקולים השבר הסינפטית כדי לחקור את UPS במיוחד על הסינפסות בתגובה ללמידה22,23,24, השיטות בשימוש סגר את היכולת למדוד . שינויים באותה החיה התוצאה היא צורך מיותר לחזור על ניסויים מספר פעמים, איסוף שבר שונה הסלולר בכל אחד. לא רק תוצאה זו היא הפסד גדול יותר של חיי בעלי חיים, אבל זה מבטל את היכולת להשוות במישרין את פעילות ה-UPS על פני תאים תת תאיים שונים בתגובה לאירוע נתון או במהלך מצב מחלה מסוים. בהתחשב בכך מטרות החלבון של אוביקוויב ו-פרוטאסאט משתנים באופן נרחב ברחבי התא, הבנה כיצד אוביקוויב-פרוטאסאט איתות שונה בתאי subcellular נפרדים הוא קריטי לזיהוי התפקיד הפונקציונלי של ה-UPS ב מוח בזמן היווצרות הזיכרון והפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות.
כדי לטפל בצורך זה, פיתחנו לאחרונה הליך שבו ניתן היה לאסוף שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית עבור אזור מוחי נתון מאותה חיה21. בנוסף, כדי להסביר את כמות החלבון המוגבלת שניתן להשיג מאיסוף שברים תת-תאיים מרובים מאותה דוגמית, אנו ממוטבים פרוטוקולים שהוקמו בעבר לצורך שיטת הפעולה של מחוץ לפעילות והצמדה בתאי חלבון שנאספו מרקמת מוח מכרסמים. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לאסוף ולהשוות ישירות שינויים תלויי למידה בפעילות פרוטאספראט, K48, K63, M1 והכולל חלבון polyubiquitination רמות בגרעין הציטופלסמה ו ב הסינפסות באמיגדלה לרוחב של חולדות. כאן, אנו מתארים בפירוט ההליך שלנו (איור 1), אשר יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה שלנו כיצד UPS מעורב ביצירת זיכרון ארוך טווח ומצבים מחלות שונות. עם זאת, יש לציין כי בפעילות החוץ בלתי מתורבת הנדונה בפרוטוקול שלנו, תוך שימוש נרחב, לא ישירות למדוד את הפעילות של השלם מתחמים 26 של המלא. ליתר דיוק, שיטת הפעולה הזו מודדת את הפעילות של הליבה של 20, כלומר היא יכולה לשמש רק כפרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול כולו 26 של מורכבות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין היא מווסת מפתח של השפלה חלבון ומגוון של תהליכים סלולריים אחרים eukaryotes. במוח, מגביר את הפעילות אוביקוויב-פרוטאספראט הם קריטיים לפלסטיות הסינפטית והיווצרות הזיכרון והשינויים החריגה במערכת זו משויכים למגוון של הפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות. אחד הנושאים ללמוד אוביקוויב-פרוטאסאט התפקוד במוח הוא שהוא קיים בכל התאים הסלולריים, שבו מטרות החלבון, התפקיד הפונקציונלי ומנגנונים של רגולציה יכול להשתנות באופן נרחב. כתוצאה מכך, היכולת להשוות במישרין את המוח אוביקוויב חלבון מיקוד ופעילות מיקרוביאלית בתאי משנה שונים בתוך אותה חיה היא קריטית להבנה מלאה כיצד UPS תורמת לפלסטיות הסינפטית, זיכרון ומחלות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת איסוף של גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית גולמיים מן מכרסם אותו (עכברוש) המוח, ואחריו כימות בו של פעילות מיקרוביאלית של הפרוטאסאט (בעקיפין, מתן פעילות של הליבה פרוטאסדום בלבד) ותיוג חלבונים אוביקוויב ספציפי לקישור. כך, ניתן להשתמש בשיטה כדי להשוות ישירות שינויים משניים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאין באזורי מוח שונים באותה חיה במהלך הפלסטיות הסינפטית, היווצרות הזיכרון ומצבי מחלה שונים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההתפלגות והתפקוד התת-תאית של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.

באמצעות ההליך המתואר כאן, גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית נאספו מן האמיגדלה לרוחב של המוח עכברוש (איור 1). טוהר השברים הבודדים אושרו באמצעות הכתמים המערביים, בודק עם נוגדנים נגד חלבונים שצריכים להיות מועשרים או מרוקנים את הליפוסט. בחצי הכדור הראשון שבו שבר ס?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

פרוטוקול זה מודד רמות חלבון תת-תאי בכל מקום ופעילות פרוטזום במוח המכרסמים המאפשרת בתוך הנבדקים להשוות את האופן שבו פעילות בכל מקום-פרוטאיום משתנה בתגובה לפעילות תאית, למידה או מחלה. הפרוטוקול מאפשר איסוף של שברים סינפטיים, ציטופלסמיים וגריוניים מאותו מוח מכרסמים. צמצום אובדן, זה יכול להתבצע עם כמויות רקמות קטנות וציוד מעבדה בסיסי.הדגימה של ההליך תהיה טיילור מקפאדן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם איסוף ותסת של רקמת המוח מכרסמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ודא כי חצי הכדור בשימוש הוא נגד מאוזן על פני תנאי החילוץ עבור כל קבוצת ניסוי.הסר את מיקרוטובת הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכילה חצי כדור אחד של אזור העניין מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח הקפואה כדי homogenizer זכוכית שני מיליליטר טפלון. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה לצינור טפלון.באמצעות עלה B, הומוגניזציה אותה רקמה עם 15 משיכות עד לא כמות גלויה של חומר מוצק קיים. השתמש בתנועה מסתובבת במהלך כל קו. עם פיפט 1,000 מיקרוליטר, העבר את הדגימה ההומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.מניחים את הצינור על קרח רטוב ודגירה במשך 30 דקות. מניחים את הצינור במיקרוצנטריפוגה ומסתובבים במשך 10 דקות ב 845 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת, להסיר בזהירות את supernatant על ידי צינורות מקום לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר.זה השבר הציטופלסמי. הוסף 50 microliters של חיץ החילוץ גלולה וכתוצאה מכך resuspend על ידי צינורות. אל תמערבולת את גלולה.מניחים את הצינור המכיל את גלולה resuspended על קרח דגירה במשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה הצינור במשך 20 דקות ב 21, 456 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant על ידי צינורות והמקום לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש.זה החלק הגרעיני. הומוגניזציה של חצי כדור אחד של אזור העניין כבעבר למעט שימוש ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר TEVP במקום במאגר תמוגה. באמצעות פיפט 1,000 מיקרוליטר, להעביר את המדגם הומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש.צנטריפוגה המדגם ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש באמצעות פיפט 1, 000 מיקרוליטר. צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השלך את גלולת המקורית המכילה גרעינים ואת הפסולת הגדולה. העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. זה השבר הציטוסולי.הוסף 50 microliters של חיץ הומוגניזציה גלולה resuspend על ידי צינורות עד חומר מוצק לא גלוי. צנטריפוגה המדגם ב 20, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.זה שבר הממברנה הסינפטוזומלי הגולמי. כדי להגדיר את ההתמדה, לפני המלחמה את קורא הלוחות ל 37 מעלות צלזיוס ולהחזיק דרך הריצה. הגדר את העירור ל 360 ננומטר ו הפליטה ל 460 ננומטר.אם לוח 96 היטב בשימוש ברור, להגדיר את מיקום אופטיקה לתחתית. אם נעשה שימוש בצלחת 96 באר כהה, הגדר את מיקום האופטיקה למעלה. תכנת ריצה קינטית עם זמן של שעתיים סריקה כל 30 דקות.יש ליישב מחדש את מאגר ההצגות 20S 10X המסופק בערכה עם 13.5 מיליליטר של מים אולטרה-יציבים. הוסף 14 מיקרוליטרים של ATP 100 מילימולר למאגר 1X עכשיו. פעולה זו משפרת באופן משמעותי את פעילות הפרוטזום בדגימות ומשפרת את אמינות המדגמים.תשב מחדש את תקן AMC המסופק בערכה עם 100 מיקרוליטרים של DMSO. בצע שלבים באמצעות תקן AMC בחושך או בתנאי תאורה נמוכה מכיוון שהתקן רגיש לאור. צור עקומה סטנדרטית של AMC מסדרה של ריכוזי AMC גבוהים עד נמוכים.עקומה זו תשמש לכיול וניתוח של פעילות פרוטזום בדגימות הומוגניות. תן מחדש את תת-התת-ת-תבליט הפרוטאזום המסופק בערכה עם 65 מיקרוליטרים של DMSO. גם לבצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה נמוכה כמו המצע הוא רגיש לאור.לאחר מכן ליצור דילול אחד עד 20 של המצע proteasome בצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר באמצעות חיץ בדיקה 20S. הוסף כמות מנורמלת של הדגימות הרצויות לצלחת 96 באר. הפעל כל דגימה בכפילות.כמות הדגימה הדרושה משתנה בהתאם להכנת רקמות. בדרך כלל, 10 עד 20 מיקרוגרם מספיק לכל שבר תת-תאי. הביאו את נפח הבאר לדוגמה ל-80 מיקרוליטר עם מים אולטרה-חמים.הסכום שנוסף תלוי באמצעי האחסון של המדגם שנוסף. בשתי בארות נפרדות, מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מים בלבד. אלה יהיו החסרים של ההתנסויות.הוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה של 20S לכל באר, כולל גם תמונות ריקות. השתמש ב-repeater או ב-pipette אוטומטי כדי להבטיח נפח מים עקבי בין בארות. כבה את האורות או הזן חדר חשוך.הוסף את כל 100 המיקרוליטרים של תקני AMC מדוללים ל באר חדשה באמצעות באר אחת לכל תקן. בחושך, השתמשו ב-repeater או בצנרת אוטומטית כדי להוסיף 10 מיקרוליטרים של מצע פרוטאזום מדולל ל בארות המכילות תווי סרק לדוגמה ומדגמים, אך לא את תקן AMC. מניחים את הצלחת לתוך קורא הלוח ולהתחיל את הריצה הקינטית.בצע כימות של תגי פוליוביקיטין מגוונים בשברים תת-תאיים שונים שנאספו מרקמת המוח המכרסמת באמצעות מגוון פרוטוקולי סופג מערביים סטנדרטיים בשילוב עם נוגדנים פוליאוביקיטין ייחודיים ספציפיים לקישור. חלק מהתמונות הכתימות המערביות בכל מקום יספקו טורים של להקות נפרדות בעוד שאחרות מפיקות תבנית דמוית מריחה עם מעט או ללא קווים ברורים. לכימות כתמים מערביים בתמונה, צייר תיבה מסביב לעמודה המרחיבה את סולם הסטנדרטים המולקולריים כולו.כוונן את התיבה אם כתמי אוביקיטין אכן נמשכים לאורך הסולם כולו. זה נפוץ עבור ליסטין 48 שינויים משתנה מאוד על פני תאים subcellular. לבסוף, הפחת את הרקע המחושב כצפיפות האופטית הממוצעת של הרקע המקיף מיד את העמודה מכל הצדדים.מוצג כאן הוא כימות של פעילות פרוטזום בשברים שונים שנאספו מן האמיגדלה מצדד של אותה חיה. במהלך בדיקה של פעילות פרוטאזום במבחנה, יחידות פלואורסצנטיות יחסיות שזוהו גדלו מתחילתו ועד סופו של ההתגלות בשבר הסינפטי, השבר הציטופלסמי והשבר הגרעיני. מעכב הפרוטאסום בטא-לאק מנע מ-RFUs להשתנות לאורך כל הפגישה.הבדלים תת-תאיים נצפו בפעילות פרוטזום באמיגדלה התת-תאית של אותה חיה. עלייה בפעילות הפרוטזום הגרעיני זוהתה בבעלי חיים מאומנים ביחס לפקדים שהתאמו לירידה בפעילות בתוך השבר הסינפטי. פעילות פרוטאזום ציטופלזמית נותרה בבסיס.מוצגים כאן הבדלים תת-תאיים בכל מקום חלבון ספציפי לקישור באמיגדלה האודם של אותה חיה לאחר הלמידה. חלה עלייה בכל מקום הכולל בשבר הגרעיני לאחר למידה אשר בקורלציה עם ירידה בשבר הציטופלסמי. לאחר הלמידה, בכל מקום ליניארי גדל שבר גרעיני אבל לא שברים ציטופלסמיים או סינפטיים.מעניין, K63 בכל מקום גדל בשבר הגרעיני לאחר למידה אשר בקורלציה עם ירידה בשבר הסינפטי. בעוד שחד-שוויון K48 גדל בשברים הגרעיניים והציטופלסמיים לאחר הלמידה, אך לא בשבר הסינפטי. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להבין את התפלגות תת תאית ותפקוד של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...