Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio del College of Agricultural and Life Sciences e il College of Science di Virginia Tech.

Tutte le procedure, comprese le materie animali, sono state approvate dal Virginia Polytechnic Institute e dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della State University (IACUC).
1. Raccolta e dissezione del tessuto cerebrale del roditore
 NOT:</</c0> Questo protocollo può essere applicato a una varietà di regioni del cervello e utilizzato con varie procedure di raccolta dei tessuti. Di seguito è riportata la procedura utilizzata nel nostro laborator...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Qui, dimostriamo un metodo efficiente per quantificare i cambiamenti nell'attività onniquitina-proteasoma attraverso diversi compartimenti subcellulari nello stesso animale. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di misurare i cambiamenti subcellulari nell'attività del sistema ubiquitina-proteasoma sono stati limitati a un singolo compartimento per campione, con conseguente necessità di ripetere gli esperimenti. Questo porta a costi significativi e perdita di vita animale. Il nostro protocollo allevia questo prob...

Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule1. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell'ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina2. Alcuni di questi tag di poliubiquitina sono specifici per degradazione (K48)3, mentre altri sono in gran parte indipendenti dal processo di degradazione delle proteine (M1)4,5,6. Pertanto, il processo di ubiquitinazione delle proteine è incredibilmente complesso e la capacità di quantificare i cambiamenti in un tag poliubiquitin specifico è fondamentale per comprendere in ultima analisi il ruolo di quella data modifica nel funzionamento cellulare. Complicando ulteriormente lo studio di questo sistema, il proteasome, cheè la struttura catalitica dell'UPS 7, degrada le proteine ma può anche essere coinvolto in altri processi non proteolitici8,9. Non sorprende quindi, dalla sua scoperta iniziale, l'attività ubiquitina-proteasosa normale e aberrante è stata implicata nella formazione della memoria a lungo termine e in una varietà di stati di malattia, tra cui molti disturbi10,11. Di conseguenza, i metodi in grado di quantificare in modo efficace ed efficiente l'attività dell'UPS nel cervello sono fondamentali per comprendere in ultima analisi come questo sistema è disregolato negli stati di malattia e l'eventuale sviluppo di opzioni di trattamento rivolte all'ubiquitina e/o funzionamento proteasome.
Ci sono una serie di problemi nella quantificazione dell'attività di ubiquitina-proteasososo nel tessuto cerebrale da ratti e topi, che sono i sistemi modello più comuni utilizzati per studiare la funzione UPS, tra cui 1) la diversità delle modifiche dell'ubiquitina, e 2) distribuzione e regolazione differenziale dell'UPS funzionante attraverso scomparti subcellulari12,13,14. Per esempio, molte delle prime dimostrazioni della funzione ubiquitina-proteasosomico nel cervello durante la formazione della memoria utilizzato lisato intere cellule e indicato aumenti dipendenti dal tempo in entrambi l'ubiquitinazione delle proteine e l'attività proteasomiana15, 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20. Tuttavia, recentemente abbiamo scoperto che l'attività di ubiquitina-proteasososo variava ampiamente attraverso i compartimenti subcellulari in risposta all'apprendimento, con aumenti simultanei in alcune regioni e diminuzioni in altre, un modello che differiva in modo significativo da quanto descritto in precedenza in lisati intericellulari 21. Ciò è coerente con la limitazione di un approccio a tutta la cellula, in quanto non può dissociare il contributo dei cambiamenti nell'attività UPS in diversi compartimenti subcellulari. Anche se studi più recenti hanno impiegato protocolli di frazione sinaptica per studiare l'UPS specificamente nelle sinapsi in risposta all'apprendimento22,23,24, i metodi utilizzati occllude la capacità di misurare cambiamenti nucleari e citoplasmaici dell'ubiquitina-proteasososo nello stesso animale. Ciò si traduce in un bisogno inutile di ripetere gli esperimenti più volte, raccogliendo una frazione subcellulare diversa in ciascuno. Questo non solo comporta una maggiore perdita di vite umane, ma elimina la capacità di confrontare direttamente l'attività UPS attraverso diversi compartimenti subcellulari in risposta a un determinato evento o durante uno stato di malattia specifico. Considerando che gli obiettivi proteici dell'ubiquitina e del proteasoso variano ampiamente in tutta la cellula, comprendere come la segnalazione onniquitina-proteasome sia diversa nei compartimenti subcellulari distinti è fondamentale per identificare il ruolo funzionale dell'UPS neurologico durante la formazione della memoria e disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici.
Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato una procedura in cui le frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche potrebbero essere raccolte per una determinata regione cerebrale dallo stesso animale21. Inoltre, per tenere conto della quantità limitata di proteine che si può ottenere raccogliendo più frazioni subcellulari dallo stesso campione, abbiamo ottimizzato protocolli stabiliti in precedenza per analisi dell'attività proteasome in vitro e proteine in cellule lisci raccolte dal tessuto cerebrale del roditore. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di raccogliere e confrontare direttamente i cambiamenti dipendenti dall'apprendimento nell'attività proteasosa, K48, K63, M1 e i livelli complessivi di poliubiquitinazione proteica nel nucleo e nel citoplasma e nelle sinapsi nell'amigdala laterale dei ratti. In questo articolo viene descritta in dettaglio la procedura (Figura 1), che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione di come l'UPS è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine e in vari stati di malattia. Tuttavia, va notato che l'attività proteasome in vitro discussa nel nostro protocollo, anche se ampiamente utilizzata, non misura direttamente l'attività di complessi proteasome 26S completi. Piuttosto, questo saggio misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso proteasome 26S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Il sistema ubiquitina-proteasoma è un regolatore chiave della degradazione delle proteine e una varietà di altri processi cellulari negli eucarioti. Nel cervello, gli aumenti dell'attività onniquitina-proteasomico sono fondamentali per la plasticità sinaptica e la formazione della memoria e i cambiamenti aberranti in questo sistema sono associati a una varietà di disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici. Uno dei problemi nello studio del funzionamento dell'ubiquitina-proteasoma nel cervello è che è presente in tutti i compartimenti cellulari, in cui i bersagli proteici, il ruolo funzionale e i meccanismi di regolazione possono variare ampiamente. Di conseguenza, la capacità di confrontare direttamente il targeting delle proteine dell'ubiquitina cerebrale e l'attività catalitica proteasosa in diversi compartimenti subcellulari all'interno dello stesso animale è fondamentale per comprendere appieno come l'UPS contribuisce alla plasticità sinaptica, memoria e malattia. Il metodo qui descritto consente la raccolta di frazioni sinaptiche nucleari, citoplasmatiche e grezze dallo stesso cervello di roditore (ratto), seguite dalla quantificazione simultanea dell'attività catalitica proteasome (indirettamente, fornendo attività del nucleo proteasome solo) e l'etichettatura della proteina ubiquitina specifica del collegamento. Così, il metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente i cambiamenti subcellulari nell'attività ubiquitina-proteasomesome in diverse regioni del cervello nello stesso animale durante plasticità sinaptica, formazione della memoria e diversi stati di malattia. Questo metodo può essere utilizzato anche per valutare la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.

Utilizzando la procedura qui descritta, sono state raccolte frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche dall'amigdala laterale del cervello del ratto (Figura 1). La purezza delle singole frazioni è stata confermata attraverso il gonfiore occidentale, sondando con anticorpi contro le proteine che dovrebbero essere arricchiti o esauriti nel lisato. Nel primo emisfero in cui è stata raccolta una frazione sinaptica grezza, la proteina di densità post-sinap...

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Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Questo protocollo misura i livelli di ubiquitinazione delle proteine subcellulari e l'attività proteasome nel cervello dei roditori consentendo all'interno dei soggetti confronti di come l'attività ubiquitina-proteasome cambia in risposta all'attività cellulare, all'apprendimento o alle malattie. Il protocollo consente la raccolta di frazioni sinaptiche, citoplasmatiche e nucleari dallo stesso cervello di roditori. Riducendo al minimo la perdita, potrebbe essere eseguita con piccole quantità di tessuto e attrezzature di laboratorio di base.A dimostrare la procedura sarà Taylor McFadden, una studentessa laureata del mio laboratorio. Inizia questa procedura con la raccolta e la dissezione del tessuto cerebrale dei roditori come descritto nel protocollo di testo. Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale.Rimuovere il microtubo di centrifuga da 1,5 millilitri contenente un emisfero della regione di interesse dal congelatore meno 80 gradi Celsius. Usando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato in un omogeneizzatore teflon in vetro da due millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi al tubo di Teflon.Usando il pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto con 15 colpi fino a quando non è presente alcuna quantità visibile di materiale solido. Utilizzate un movimento di tornitura durante ogni tratto. Con una pipetta da 1.000 microlitri, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Posizionare il tubo sul ghiaccio bagnato e incubare per 30 minuti. Posizionare il tubo nel microcentrifugo e girare per 10 minuti a 845 volte g in quattro gradi Celsius. Dopo il completamento, rimuovere con cura il supernatante tubazione e posizionare in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Questa è la frazione citoplasmatica. Aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione al pellet risultante e rimostrare mediante pipettazione. Non vortice il pellet.Posizionare il tubo contenente il pellet rimorsificato sul ghiaccio e incubare per 30 minuti. Quindi centrifugare il tubo per 20 minuti a 21,456 volte g in quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante tubazione e posizionarsi in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Questa è la frazione nucleare. Omogeneizzare un emisfero della regione di interesse come in precedenza, ad eccezione dell'uso di 500 microlitri di buffer TEVP anziché di buffer di lisi. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Centrifugare il campione a 1.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il supernatante e trasferirlo su un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri. Centrifugare il campione a 10.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il pellet originale che contiene nuclei e detriti di grandi dimensioni. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Questa è la frazione citosolica.Aggiungere 50 microlitri di tampone di omogeneizzazione al pellet e rimorsi mediante pipettazione fino a quando non è visibile alcun materiale solido. Centrifugare il campione a 20.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.Questa è la frazione grezza della membrana sinaposomica. Per impostare il saggio, prewarm il lettore di piastre a 37 gradi Celsius e tenere attraverso la corsa. Impostare l'eccitazione a 360 nanometri e l'emissione a 460 nanometri.Se la piastra del pozzo 96 utilizzata è chiara, impostare la posizione dell'ottica sul fondo. Se si utilizza una piastra scura da 96 pozza, impostare la posizione ottica verso l'alto. Programma un'esecuzione cinetica con un tempo di scansione di due ore ogni 30 minuti.Ricostituire il tampone di dosaggio 20S 10X fornito nel kit con 13,5 millilitri di acqua ultrapura. Aggiungere 14 microlitri di ATP da 100 millimolare all'ormai 1X buffer. Ciò migliora significativamente l'attività proteasome nei campioni e migliora l'affidabilità del saggio.Ricostituire lo standard AMC fornito nel kit con 100 microlitri di DMSO. Eseguire i passaggi utilizzando lo standard AMC al buio o in condizioni di scarsa illuminazione in quanto lo standard è sensibile alla luce. Creare una curva standard di AMC da una serie di concentrazioni AMC da alte a basse.Questa curva verrà utilizzata per la calibrazione del lettore di lastre e l'analisi dell'attività proteasome nei campioni omogeneizzati. Ricostituire il sottotrato proteasome fornito nel kit con 65 microlitri di DMSO. Eseguire anche questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione in quanto il substrato è sensibile alla luce.Quindi creare una diluizione da uno a 20 del substrato proteasome in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri utilizzando il tampone di dosaggio 20S. Aggiungere una quantità normalizzata dei campioni desiderati a una piastra di 96 pozza. Eseguire ogni campione in duplicato.La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione dei tessuti. Generalmente, da 10 a 20 microgrammi è sufficiente per qualsiasi frazione subcellulare. Portare il volume del pozzo del campione a 80 microlitri con acqua ultrapura.La quantità aggiunta dipende dal volume del campione aggiunto. In due pozzi separati, aggiungere 80 microlitri di acqua da soli. Questi saranno gli spazi vuoti del saggio.Aggiungere 10 microlitri di tampone di dosaggio 20S a ciascun pozzo, inclusi gli spazi vuoti di dosaggio. Utilizzare un ripetitore o una pipetta automatizzata per garantire un volume di dosaggio costante attraverso i pozzi. Spegnere le luci o entrare in una stanza buia.Aggiungere tutti i 100 microlitri di standard AMC diluiti a un nuovo pozzo utilizzando un unico pozzo per ogni standard. Al buio, utilizzare un ripetitore o una pipetta automatizzata per aggiungere 10 microlitri di substrato proteasome diluito a pozzi contenenti campioni e spazi vuoti di dosaggio, ma non lo standard AMC. Posizionare la piastra nel lettore di lastre e iniziare la corsa cinetica.Eseguire la quantificazione di diversi tag di poliubiquitina in diverse frazioni subcellulari raccolte dal tessuto cerebrale dei roditori utilizzando una varietà di protocolli di gonfiore occidentali standard in combinazione con anticorpi poliubiquini specifici del collegamento unici. Alcune immagini macchie occidentali ubiquitina forniranno colonne di bande distinte, mentre altre producono motivi simili a strisci con poche o nessuna linea chiara. Per la quantificazione dell'ubiquità immagine nelle macchie occidentali, disegnare una scatola attorno alla colonna che estende l'intera scala degli standard molecolari.Regolare la scatola se la colorazione dell'ubiquitina si estende attraverso l'intera scala. Questo è comune per le modifiche alla lsina 48 e varia ampiamente tra i compartimenti subcellulari. Infine, sottrarre lo sfondo che viene calcolato come densità ottica media dello sfondo che circonda immediatamente la colonna su tutti i lati.Qui è mostrata la quantificazione dell'attività proteasome in diverse frazioni raccolte dall'amigdala laterale dello stesso animale. Durante il saggio di attività proteasome in vitro, le unità fluorescenti relative rilevate sono aumentate dall'inizio alla fine del saggio nella frazione sinaptica, nella frazione citoplasmatica e nella frazione nucleare. L'inibitore del proteasome beta-lac impediva alle RFU di cambiare durante la sessione.Differenze subcellulari sono state osservate nell'attività proteasome nell'amigdala laterale dello stesso animale. Un aumento dell'attività del proteasome nucleare è stato rilevato negli animali addestrati rispetto ai controlli che corrispondevano ad una diminuzione dell'attività all'interno della frazione sinaptica. L'attività del proteasome citoplasmatico è rimasta al basale.Qui sono mostrate differenze subcellulari nell'ubiquitinazione proteica specifica del collegamento nell'amigdala laterale dello stesso animale dopo l'apprendimento. C'è stato un aumento dell'ubiquitinazione complessiva nella frazione nucleare dopo l'apprendimento che si è correlato con una diminuzione della frazione citoplasmatica. Dopo l'apprendimento, l'ubiquitinazione lineare è aumentata nella frazione nucleare ma non nelle frazioni citoplasmatiche o sinaptiche.È interessante notare che l'ubiquitinazione del K63 è aumentata nella frazione nucleare dopo l'apprendimento che si è correlato con una diminuzione della frazione sinaptica. Mentre l'uniquitinazione del K48 è aumentata nelle frazioni nucleari e citoplasmatiche dopo l'apprendimento, ma non nella frazione sinaptica. Questo protocollo può anche essere usato per comprendere la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.

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