Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Bu çalışma, tarım ve Yaşam Bilimleri Koleji ve Virginia Tech Bilim Koleji başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. tan, Virginia Tech 'de George Washington Carver programı tarafından desteklenmektedir.

Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedürler Virginia Politeknik Enstitüsü ve Devlet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. kemirgen beyin dokusu toplama ve diseksiyon
Not: Bu protokol çeşitli beyin bölgelerine uygulanabilir ve çeşitli doku toplama prosedürleri ile kullanılabilir. Aşağıda 8-9 hafta eski erkek Sprague Dawley fareler kullanarak, sıçan beyin dokusu ...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Burada, aynı hayvanın farklı hücre içi bölmeleri boyunca Ubiquitin-proteasom aktivitesinde yapılan değişikliklerin ölçülmeleri için etkili bir yöntem gösteriyoruz. Şu anda, Ubiquitin-proteasome sisteminin aktivitesinde hücre altı değişiklikleri ölçme girişimleri çoğu örnek başına tek bir bölme ile sınırlıdır, denemeler tekrarlamak gerek sonuçlanan. Bu önemli maliyetlere ve hayvan yaşamının kaybına yol açar. Protokollerimiz, aynı hayvanın her yarımküünden toplanacak farklı hü...

Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS), hücreler1' de en kısa ömürlü proteinlerin bozulmasını kontrol eden birbirine bağlı protein yapıları ve ligazların karmaşık bir ağıdır. Bu sistemde, proteinlerin bozulması veya diğer hücresel süreçler için işaretlenmiş/küçük değiştirici Ubiquitin tarafından kaderleridir. Bir hedef protein, bir önceki Ubiquitin2' de yedi lizin (K) sitelerden (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63) veya N-terminal metiyoninin (M1; doğrusal olarak bilinen) birinde birlikte bağlanabilen 1-7 Ubiquitin modifikasyonları elde edebilir. Bu polyubiquitin etiketleri bazıları bozulmaya özeldir (K48)3, diğerleri büyük ölçüde protein bozulması süreci bağımsız iken (M1)4,5,6. Böylece, protein mayası süreci inanılmaz karmaşık ve belirli bir polyubiquitin etiketi değişiklikleri ölçmek için yeteneği sonuçta hücresel işleyişinde verilen değişikliğin rolünü anlamak için önemlidir. Bu sistemin çalışmayı daha da zorlaştıran, UPS7' nin katalitik yapısı olan proteasom, her iki proteini de düşürür, ancak diğer proteolitik olmayan süreçlerde de yer alabilir8,9. Daha sonra, ilk keşfi, normal ve anormal Ubiquitin-proteasom aktivitesi uzun süreli bellek oluşumu ve birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar Devletler, karışmıştır beri şaşırtıcı değil bozukluklar10,11. Sonuç olarak, beyindeki UPS aktivitesini etkili ve verimli bir şekilde ölçen Yöntemler, sonuçta bu sistemin hastalık Devletlerinde nasıl disdüzenli olduğunu ve Ubiquitin ve/veya hedef alan tedavi seçeneklerinin nihai gelişimini anlamak için önemlidir proteasom işleyişi.
1) Ubiquitin modifikasyonları çeşitliliği ve 2) dağılımı dahil olmak üzere, UPS fonksiyonunu incelemek için kullanılan en yaygın model sistemleri olan fareler ve farelerden gelen beyin dokusunda Ubiquitin-proteasom aktivitesinin ölçüldiği bir dizi sorun vardır. UPS 'in hücre içi bölmeler arasında işleyişi diferansiyel Yönetmeliği12,13,14. Örneğin, bellek oluşumu sırasında beyinde Ubiquitin-proteasom fonksiyonunun erken gösterilerinin çoğu, her iki protein mayası ve proteozom aktivitesinde zaman bağımlı artışları ve belirtilen tüm hücre endoglikozidazları kullanılır15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. ancak, son zamanlarda bu Ubiquitin-proteasome aktivite yaygın olarak öğrenme yanıt olarak alt hücre bölmeleri arasında çeşitli bulundu, bazı bölgelerde eşzamanlı artışlarla ve diğerlerinden azalır, önemli ölçüde farklıdır bir desen daha önce tüm hücre endoglikozidazları21bildirildi. Bu, tüm hücre yaklaşımlarının sınırlandırılmasıdır, çünkü bu, UPS aktivitesindeki değişikliklerin farklı alt hücresel bölmeler boyunca katkılarını ayıramaz. Yine de daha yeni çalışmalar araştırmada sinapses özellikle de UPS çalışmak için sinaptik kesir protokolleri istihdam var22,23,24, yöntemleri ölçmek için occlude kullanılan yöntemler aynı hayvanda nükleer ve sitoplazmik Ubiquitin-proteasom değişiklikleri. Bu, her biri farklı bir hücre altı fraksiyonu toplama, deneyler birden çok kez tekrarlamak için gereksiz bir ihtiyaç sonuçlanır. Bu, sadece hayvan hayatlarını daha büyük bir kayıpla sonuçlanır, ancak belirli bir olaya veya belirli bir hastalık durumunda yanıt olarak farklı hücre içi bölmeler arasında UPS etkinliğini doğrudan karşılaştırmak için yeteneğini ortadan kaldırır. Ubiquitin ve proteasomun protein hedeflerini göz önünde bulundurarak hücre boyunca yaygın olarak farklılık gösterir, nasıl Ubiquitin-proteozom sinyalizasyon farklı alt hücre bölmeler farklıdır anlamak UPS işlevsel rolünü belirlemek için önemlidir beyin bellek oluşumu ve nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar sırasında.
Bu gereksinimi ele almak için, Geçenlerde aynı hayvan21gelen belirli bir beyin bölgesi için nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplanan olabilir bir prosedür geliştirdik. Ayrıca, aynı örnekten birden fazla hücre altı fraksiyonları toplama elde edilebilir protein sınırlı miktarda hesaba, biz tahlil in vitro proteozom aktivite ve bağlantı spesifik için önceden kurulan protokolleri optimize kemirgen beyin dokusundan toplanan lysed hücrelerinde protein mayası. Bu protokolü kullanarak, biz toplamak ve doğrudan proteasom aktivite, K48, K63, M1 ve Atom ve sitoplazmada genel protein polyubiquitination düzeylerinde öğrenme bağımlı değişiklikleri karşılaştırmak başardık ve fareler lateral amigdala sinaps. Burada, UPS 'in uzun süreli bellek oluşumu ve çeşitli hastalık Devletlerinde nasıl yer aldığı konusunda anlayışımızı önemli ölçüde iyileştiren prosedürlerimizi ayrıntılı olarak tarif ediyoruz (Şekil 1). Ancak, bizim protokolde tartışılan in vitro proteasom aktivite, yaygın olarak kullanıldığında, doğrudan tam 26S proteozom kompleksleri aktivitesini ölçmek değil unutulmamalıdır. Yerine, bu tahlil 20s çekirdek etkinliğini ölçer, sadece bir vekil olarak tüm 26S proteozom kompleks aksine çekirdek kendisi etkinliğini anlamak için hizmet edebilir anlamına gelir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Ubiquitin-proteasom sistemi, protein bozulması ve ökaryotlar içindeki diğer hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisidir. Beyinde, Ubiquitin-proteasom aktivitesinde artar sinaptik plastisite ve bellek oluşumu için kritik ve bu sistemde anormal değişiklikler nörolojik çeşitli ile ilişkilidir, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar. Beyin içinde Ubiquitin-proteasome işleyişi okuyan sorunlardan biri, tüm hücresel bölmeler içinde mevcut olmasıdır, hangi protein hedefleri, fonksiyonel rol ve düzenleme mekanizmaları yaygın olarak değişebilir. Sonuç olarak, aynı hayvan içinde farklı hücre içi bölmeler içinde beyin Ubiquitin protein hedefleme ve proteasom katalitik aktivite doğrudan karşılaştırmak için yeteneği tam olarak nasıl UPS sinaptik plastisite katkıda anlaşılması için önemlidir, bellek ve hastalık. Burada açıklanan yöntem, aynı kemirgen (sıçan) beyinden gelen nükleer, sitoplazmik ve ham sinaptik fraksiyonlar toplamasının ardından, proteasom katalitik aktivitesinin eşzamanlı ölçülmesini (dolaylı olarak, proteasom çekirdeğinin etkinliğini sağlayarak) sağlar Sadece) ve bağlantıya özgü Ubiquitin proteini etiketleme. Böylece, yöntem doğrudan sinaptik plastisite, bellek oluşumu ve farklı hastalık durumları sırasında aynı hayvan farklı beyin bölgelerinde Ubiquitin-proteasome aktivite hücre altı değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, aynı hayvan içindeki diğer proteinlerin alt hücresel dağıtımı ve fonksiyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir.

Burada açıklanan prosedürü kullanarak, sıçan beynin lateral amigdala nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplandı (Şekil 1). Bireysel fraksiyonları saflık Batı blotting ile teyit edildi, zenginleştirilmiş veya lysate tükenmelidir proteinlere karşı antikorlar ile yoklama. Ham sinaptik fraksiyonu toplanan ilk yarımküte, postsinaptik yoğunluk protein 95 (PSD95) sinaptik vardı, ancak nükleer değil, kesir, sitoplazmada alt seviye...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Bu protokol, hücre altı protein ubiquitination düzeyleri ve kemirgen beyin proteozom aktivitesi ölçüyor nasıl hücresel aktivite, öğrenme, ya da hastalığa yanıt olarak ubikitin-proteozom aktivite değişiklikleri konular içinde karşılaştırmalar içinde izin. Protokol aynı kemirgen beyinden sinaptik, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların toplanmasına izin verir. Kaybı en aza indirmek, küçük doku miktarları ve temel laboratuvar ekipmanları ile yapılabilir.Prosedürü gösteren Taylor McFadden, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Metin protokolünde açıklandığı gibi kemirgen beyin dokusunun toplanması ve diseksiyonu ile bu prosedüre başlayın. Kullanılan yarımkürenin her deney grubu için ekstraksiyon koşulları arasında dengelendiğinden emin olun.Eksi 80 derece santigrat dondurucu ilgi bölgenin bir yarımküreiçeren 1.5 mililitrelik centrifuge mikrotüp çıkarın. Neşter kullanarak donmuş beyin dokusunu iki mililitrelik cam Teflon homogenizer'e aktarın. Teflon tüpüne 500 mikrolitre lysis tamponekleyin.B noluba kullanarak, görünür miktarda katı madde bulununa kadar aynı dokuyu 15 vuruşla homojenize edin. Her vuruş sırasında bir dönüş hareketi kullanın. 1,000 mikrolitrelik pipetile homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Tüpü ıslak buzüzerine yerleştirin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Mikrocentrifuge tüp yerleştirin ve dört santigrat derece 845 kez g 10 dakika spin. Tamamlandıktan sonra, dikkatle pipetleme tarafından supernatant çıkarın ve yeni bir 1.5 mililitremikrosantrifüj tüp içine yerleştirin.Bu sitoplazmik fraksiyon. Elde edilen pelet için ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile resuspend. Peleti girdap etmeyin.Yeniden askıda pelet içeren tüpü buzüzerine yerleştirin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 21, 456 kez dört derece santigrat g 20 dakika boyunca tüp santrifüj. Santrifüjden sonra, pipetleme ile supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.Bu nükleer kesir. Daha önce olduğu gibi ilgi bölgesinin bir yarımküresini homojenize etmek dışında 500 mikrolitre TEVP tamponu yerine lysis tamponu kullanın. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak, homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Numuneyi 1,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant toplamak ve 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın. Numuneyi 10,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Çekirdekleri ve büyük enkaz içeren orijinal pelet atın. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın. Bu sitosolik kesir.Pelete 50 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin ve katı madde görünmeyene kadar pipetleme ile yeniden askıya alın. Numuneyi 20,000 kez 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.Bu ham sinaptozomal membran fraksiyonu. Tazyiki ayarlamak için plaka okuyucuyu 37 dereceye ısıtın ve koşuboyunca tutun. Uyarmayı 360 nanometreye, emisyonise 460 nanometreye ayarlayın.Kullanılan 96 iyi plaka sıyrıksa, optik konumu dibe doğru ayarlayın. Koyu bir 96 kuyu plakası kullanılırsa, optik konumu en üste ayarlayın. Her 30 dakikada bir iki saatlik bir tarama süresi yle bir kinetik çalışma programı.13,5 mililitre ultra saf su ile kitinde sağlanan 20S 10X titreşme tamponu yeniden oluşturun. Şimdi 1X tampon 100 milimolar ATP 14 mikrolitre ekleyin. Bu önemli ölçüde örneklerde proteozom aktivitesini artırır ve test güvenilirliğini artırır.100 mikrolitre DMSO ile kitte sağlanan AMC standardını yeniden oluşturun. Standart ışığa duyarlı olduğu için karanlıkta veya düşük ışık koşullarında AMC standardını kullanarak adımlar atın. Yüksek ten düşük AMC konsantrasyonlarına kadar standart bir AMC eğrisi oluşturun.Bu eğri, homojenize numunelerde plaka okuyucu kalibrasyonu ve proteozom aktiviteanalizi için kullanılacaktır. 65 mikrolitre DMSO ile kitte sağlanan proteozal subtrate'yi yeniden oluşturun. Ayrıca substrat ışığa duyarlı olduğu gibi karanlıkta veya düşük ışık koşullarında bu adımı gerçekleştirin.Sonra 20S tsay tampon kullanarak yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp proteozom substrat bir ila 20 seyreltme oluşturun. 96 kuyu plakasına istenilen numunelerin normalleştirilmiş miktarını ekleyin. Her örneği yinelenen olarak çalıştırın.İhtiyaç duyulan numune miktarı doku hazırlığına göre değişir. Genellikle, 10-20 mikrogram herhangi bir hücre altı fraksiyonu için yeterlidir. Numune nin iyi hacmini ultra saf suyla 80 mikrolitreye getirin.Eklenen miktar, eklenen numunenin hacmine bağlıdır. İki ayrı kuyuda, sadece 80 mikrolitre su ekleyin. Bunlar tsay boşlukları olacak.Her iyi de istinat boşlukları da dahil olmak üzere 20S tsay arabellek 10 mikrolitre ekleyin. Kuyular arasında tutarlı bir hesap hacmi sağlamak için tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın. Işıkları kapatın veya karanlık bir odaya girin.Seyreltilmiş AMC standartlarının 100 mikrolitresini her standart için tek bir kuyu kullanarak yeni bir kuyuya ekleyin. Karanlıkta, numune ve test boşlukları içeren kuyulara 10 mikrolitre seyreltilmiş proteozom substrat eklemek için tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın, ancak AMC standardı na uygun değildir. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik çalıştırmaya başlayın.Kemirgen beyin dokusundan toplanan farklı hücre altı fraksiyonlarda farklı poliubiquitin etiketlerinin sayısallaştırılmasını benzersiz bağlantıya özgü poliubiquitin antikorları ile birlikte çeşitli standart Batı lekeleme protokolleri kullanarak gerçekleştirin. Bazı ubiquitin Batı leke görüntüleri farklı bantları sütunlar sağlarken diğerleri az veya hiç net çizgileri ile karalama benzeri desen üretir. Görüntülenmiş ubiquitin Batı lekeleri nicelik lendirmek için, tüm moleküler standartlar merdiveni uzanan sütun etrafında bir kutu çizin.Ubiquitin boyama tüm merdiven boyunca uzanır varsa kutuyu ayarlayın. Bu lizin için yaygındır 48 değişiklikler ve hücre altı bölmeleri arasında yaygın olarak değişir. Son olarak, her taraftaki sütunu çevreleyen arka planın ortalama optik yoğunluğu olarak hesaplanan arka planı çıkarın.Burada gösterilen farklı fraksiyonlarda proteozom aktivitenin nicelaynı hayvanın lateral amigdala toplanan. In vitro proteozoaktivite teşbiti sırasında, sinaptik fraksiyon, sitoplazmik fraksiyonve nükleer fraksiyonda sinaptik fraksiyonda sinadersin başından sonuna kadar artmış saptanan göreceli floresan üniteler. Proteozom inhibitörü beta-lak rus'ların seans boyunca değişmesini engelledi.Aynı hayvanın lateral amigdalasında proteozom aktivitesinde subsellüler farklılıklar gözlendi. Sinaptik fraksiyoniçinde aktivitede azalmaya karşılık gelen kontrollere göre eğitimli hayvanlarda nükleer proteozom aktivitesinde artış saptırıldı. Sitoplazmik proteozom aktivitesi başlangıç seviyesinde kaldı.Burada gösterilen öğrenme sonrasında aynı hayvanın lateral amigdala bağlantı ya da spesifik protein ubiquitination subsellüler farklılıklar vardır. Sitoplazmik fraksiyondaki azalma ile ilişkili öğrenme sonrasında nükleer fraksiyonda genel olarak her yerde artış oldu. Öğrenmeden sonra, lineer ubiquitination nükleer fraksiyonu arttı ama sitoplazmik veya sinaptik fraksiyonları değil.İlginçtir, K63 ubiquitination sinaptik fraksiyonu bir azalma ile ilişkili öğrenme sonrasında nükleer fraksiyonu arttı. K48 uniquitination öğrenme den sonra nükleer ve sitoplazmik fraksiyonları arttı ama sinaptik fraksiyonu değil. Bu protokol aynı hayvanın içindeki diğer proteinlerin hücre altı dağılımını ve işlevini anlamak için de kullanılabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...