Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde støttes primært af DOD OCRP Early Career investigators Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD investigator initieret Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for ovariecancer og Michigan ovariecancer Alliance. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute i National Institutes of Health under tildeling nummer P30CA046592. CMN er understøttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship i henhold til Grant No. 1256260. MEB støttes af Department of Education graduate assistance i områder af national Need (GAANN) Fellowship.

Alle patientprøver indsamles i henhold til en godkendt IRB-protokol fra samtykkende patienter, hvis prøver afidentificeres efter tumor tumor reduktions og ascites-samlingen.
1. generering af Sfæroider fra små Cellenumre i 384-godt hængende dråbe plader
<ol><li>Placer den hængende dråbe plade i en sonicator fyldt med steril deioniseret (DI) vand og sonikere i 20 minutter.</li>
	<li>Med en dykket hånd fjernes pladen fra sonicatoren og vaskes med rindende DI-vand.</li>
	<li>Lad pladen ...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells.">Cancer Stem Cells.</a> New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+In+Vitro+Model+of+Ovarian+Cancer+Stem-like+Cells+with+an+Enhanced+Proliferative+Capacity.">Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity.</a> Cancer Research. 76, 150-160 (2016).</li><li>P&#225;ez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Dormancy:+A+Model+of+Early+Dissemination+and+Late+Cancer+Recurrence.">Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence.</a> Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).</li><li>Murphy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alternative+in+vivo+drug+screening+methodology:+a+single+mouse+analysis.">Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis.</a> Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+Xenograft+models:+An+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening.">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture.">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li><li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Renewal+and+CSCs+In+Vitro+Enrichment:+Growth+as+Floating+Spheres.">Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres.</a> Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays.">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites.">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

384-godt hængende drop Plate platform til 3D sfæroide formation er et let implementeret værktøj til enhver cellebiologi eller cancerbiologi Labs. Denne fysiologiske platform muliggør studiet af cellelinjer, samt, primære patientprøver inden for fysiologisk relevante 3D-kulturer samtidig giver mulighed for høj gennemstrømning Drug screening. Platformen sikrer også, at kultur forholdene er meget tunbare, hvilket muliggør stram kontrol over plating tætheder, celle Co-kultur nøgletal, ekstracellulære komponente...

Verdensomspændende kræft relateret dødelighed nåede en vejafgift på 9.800.000 dødsfald i 20181, hvilket understreger behovet for udvikling af forbedrede terapeutiske. Desværre, omkostningerne ved at udvikle kræftmedicin er stigende, med udviklingen af et enkelt stof koster ca 650.000.000 USD2 angiver behovet for forbedrede strategier til at udvikle nye anti-cancer narkotika. Kræft stamceller (CSCs), som er karakteriseret ved øget chemoresistance3, evnen til at selv forny, og evnen til at frø nye tumorer4 menes at være ansvarlig for tumor recidiv4, metastase5, og chemoresistance4,6, som alle bidrager til den maligne kapacitet af tumoren og dermed den høje dødstal. I kræft i æggestokkene, disse celler er fundet beriget i den maligne ascites væske i bughulen, en tilstand forbundet med dårlige kliniske resultater1. Som et resultat af de ondartede kapaciteter af CSCs, har der været et skub til at udvikle nye CSC målretning narkotika til brug i forbindelse med traditionelle kemoterapeutika. Der er flere udfordringer, der ledsager udviklingen af CSC målretning narkotika herunder: 1) vanskeligheder med at udvide og vedligeholde CSCs in vitro; 2) mangel på patientprøver; 3) den fysiologiske relevans af kultur platformen; og 4) heterogenitet i lægemiddel følsomhed mellem patienter. Denne protokol skitserer gennemførelsen af en høj gennemløb 3D kultur platform, der kan overvinde hver af disse udfordringer. Dette system giver især mulighed for hurtig lægemiddel screening ved hjælp af et lille antal patient afledte ovarie-CSCs og er meget modtagelig for downstream-analyseteknikker. Mens ideel til at studere kræft i æggestokkene og CSCs, vores platform er også værdifuldt i at studere andre kræftformer og differentierede celletyper i komplekse 3D-miljøer.
Komplekse 3-dimensionelle (3D) modeller er afgørende for at studere tumor mikromiljø (TME), som er en 3D niche består af kræftceller, ikke-kræft støtte celler, og ekstracellulære matrix (ECM) proteiner4. Dette 3D-miljø resulterer i unikke celle morfologi, celle celle-og cellematrix interaktioner, Celledifferentiering, celle migration, celletæthed og diffusions gradienter sammenlignet med traditionel 2D-cellekultur in vitro4. Alle disse faktorer kulminerede i differentiallægemiddel respons inden for 3D-kulturer, udviser øget resistens over for lægemidler og fysiologisk relevans7,8. På grund af den rolle 3D TME i CSC differentiering og chemoresistance, er det vigtigt at screene for CSC målretning narkotika i fysiologisk mikromiljøer. Forbedring af den fysiologiske relevans af CSC Drug screening platforme har potentiale til at forbedre patientspecifikke Drug screening, narkotika udvikling, formulering af behandlingsstrategier, og i sidste ende kliniske resultater. Det er lige så vigtigt, at platformen anvendes til Drug screening være høj gennemløb og kompatibel med downstream analysemetoder til at minimere omkostninger, tid og klinisk oversættelse tid af lovende narkotika9.
I øjeblikket, den komplekse TME er bedst vedligeholdt for Drug screening applikationer gennem in vivo modeller såsom murine og tumormodeller, celle line-afledte xenografts, og patient-afledte xenograft (PDX) modeller12, da de giver fysiologisk Betingelser. Men den lave-gennemløb karakter af disse modeller, samt, de omkostninger, tid, og tekniske færdigheder, som de kræver begrænser deres nytte i hurtige, høj gennemløb Drug screening applikationer13. Som alternativer til disse in vivo modeller, mange in vitro 3D-modeller udnytter silicagelrogeler8, kultur inden for mikrofluidisk enheder eller ' orgel-on-a-chip ' enheder10,14, og ikke-tilhængere kulturer3,8 er også blevet udviklet på grund af deres lave adgangsbarriere i form af omkostninger, tid og krævede skillset.
Hydrogel kultur platforme er fordelagtige i den fine kontrol, der ydes over matrix sammensætning, mekaniske egenskaber, og matrixstruktur15; Men, de kan hæmme høj densitet cellekultur14. Desuden, høst celler fra silicagelrogeler kan komplicere downstream analyse, på grund af potentielt skadelige virkninger af høstmetoder15. Microfluidic-enheder er på den anden side mikroskala anordninger, der giver mulighed for output detektering inden for samme enhed og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimal indtagelse af reagenser, nedsat reaktionstid, minimeret spild og hurtig diffusion14. Disse egenskaber gør dem lovende platforme for at undersøge lægemiddeltoksicitet, virkning og farmakokinetik. Men udfordringerne ved effektiv, kvantificerbar, reproducerbare og brugervenlig 3D-cellekultur samt, voluminøse og dyre pumpesystemer har begrænsede mikrofluidiske applikationer i forskning med høj gennemløb10. Effektive detekterings opsætninger og potentielt vanskelige gennemførelse på tværs af felter har også forhindret udbredt anvendelse af mikrofluidisk-systemer10.
I modsat, sfæroider genereret i ikke-vedhængende forhold i roterende blandere (nutatorer), ultra-lav vedhæftnings plader og hængende dråber omfatter ikke brugerdefinerede matrixkomponenter. Disse metoder er især relevante for studiet af kræft i æggestokkene, da de ikke-overliggende betingelser er repræsentative for de tilstande, hvor sfæroider vokser inden for bughulen5. Inden for disse ikke-vedhængende dyrkningsmetoder har nutator og hængende dråbe sfæroider vist sig at udvise højere komprimering, remodeling og chemoresistance sammenlignet med sfæroider genereret i ultra-lave fastgørelses plader, hvilket tyder på øget fysiologisk relevans16,17,18,19. På grund af øget kapacitet til høj gennemløbs screening fra mindre brønd størrelser og minimale påkrævede cellenumre er sfæroide-generering i hængende dråbe plader en ideel platform til lægemiddel screening. Her præsenterer vi en tunable 3D fysiologisk platform i 384-godt hængende dråbe plader, der er let at implementere og meget modtagelig for downstream analyse, hvilket gør det ideelt til høj gennemløb Drug screening af kræft i æggestokkene og æggestokkene CSCs.
Vores 3D fysiologisk platform giver alle fordelene ved 3D-kultur, herunder fysiologiske celle celle kontakter, diffusions gradienter, celle tætheder og naturligt producerede ECM-proteiner, som kan bidrage til realistiske lægemiddel responser16, 17,18,19. Desuden, ved at generere disse sfæroider med patient-afledte CSCs, vi er i stand til at bestemme patientens specifikke respons på narkotika1 med mange tekniske replikater samtidig, at overvinde heterogenitet, der kan findes inden patient tumor prøver20. Desuden, 3D kultur har vist sig at øge vedligeholdelsen af CSC populationer3,16 og dermed er repræsentativ for beriget CSC populationer i ascites7. Dette kombineret med let downstream analyse, herunder flow flowcytometri analyse af levedygtighed og CSC proportioner giver mulighed for optimal evaluering af CSC målretning Drug effekt. Endelig er denne fysiologiske platform kompatibel med billeddannelse på flere tidspunkter under eksperimentet, evaluering af celledød og-spredning, celle organisering og morfologi med immun histokemi, opløselig signalering med ELISA på konditioneret mellem, celle fænotyper med flow cytometri og genekspression efter PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

I denne protokol skitserer vi proceduren for generering af tumor sfæroider inden for 384-godt hængende dråber for at give mulighed for høj gennemløb screening af anti-cancer Therapeutics i en fysiologisk repræsentative mikromiljø. Vi skitserer dannelsen af patient afledte kræft stamceller sfæroider, samt, manipulation af disse sfæroider til grundig analyse efter narkotikabehandling. Specifikt, vi beskriver indsamling af sfæide morfologi, proliferation, levedygtighed, lægemiddeltoksicitet, celle fænotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokol fokuserer stærkt på analyseteknikker, der let implementeres ved hjælp af 384-godt hængende drop platform, hvilket gør den ideel til høj gennemstrømning Drug screening. Mens vi understrege betydningen af denne model i ovariecancer undersøgelser og kræft stamcelleforskning, den 384-Well platform er modtagelig for forskning af andre kræfttyper og sygdomsmodeller, udvide nytten af platformen til mange områder. Ved at forbedre hastigheden af personlig Drug screening og kvaliteten af screening resultater gennem let implementeret fysiologisk repræsentative 3D-kulturer, denne platform er forudsagt til at støtte i udviklingen af nye lægemidler og patient-specifikke behandlingsstrategier og har dermed vidtrækkende klinisk virkning.

Sfæroider dannet med cellelinjer eller patient afledte CSCs kan dannes med en række små cellenumre inden for hængende dråber (figur 2a). Sfæroider dannes pålideligt med så få som 10 celler pr. brønd, hvilket gør det muligt at bevare sjældne patientprøver. Celler inden for disse sfæroider er omgivet af andre celler i 3 dimensioner, som de ville være in vivo, giver mulighed for fysiologisk celle celle kontakter og diffusion satser. Tumor celler i sfæroider prolifererer forårsa...

Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

Denne protokol beskriver generering af patient afledte sfæroider og downstream-analyse, herunder kvantificering af proliferation, cytotoksicitets test, flow cytometri, immunofluorescens farvning og konfokale billeder, med henblik på at vurdere Kandidaternes potentiale som anti-neoplastisk terapi. Denne protokol understøtter præcisionsmedicin med identifikation af specifikke lægemidler for hver patient og sygdomsstadie.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Vores protokol giver en enkel metode til 3D-celle kultur og er meget modtagelig for downstream analyse. Dette letter evalueringen af heterogene patientprøver og deres specifikke lægemiddelresponser. Fordelen ved denne teknik er, at sfæroider kan dannes af små celletal, der giver mulighed for både bevarelse af knappe primære prøver, og høj gennemløb screening for patient-specifikke lægemiddelreaktioner.Den hængende dråbe model skaber et fysiologisk miljø med 3D-stof diffusion og gør svar svarende til tumor fase. Dette giver mulighed for udvikling af målrettede behandlinger og patientspecifikke behandlinger. Denne metode er ideel til at studere kræft i æggestokkene, heterogenitet og udvikling af kemoresistens.Men, Det kan også bruges til at studere andre kræftformer og resistente cellepopulationer. Når plating sfæroider, er det vigtigt at pipette præcise mængder. Dette sikrer overensstemmelse mellem sfæroider.De sfæroider og deres respektive dråber er i sagens natur skrøbelige og let tabt uden korrekt håndtering, derfor vil vi vise, hvordan man korrekt plade, vedligeholde og analysere en hængende drop plade. Demonstration af denne procedure vil være Michael Bregenzer, en kandidat studerende fra vores laboratorium. Start med at fylde hver brønd af den seks-brønd plade med fire til fem milliliter autoklave deioniseret vand og sandwiching den hængende dråbeplade mellem låget og bunden af pladen.Tilsæt 800 til 1000 mikroliter vand omkring kanten af den hængende dråbeplade for at give et fugtigt miljø og minimere fordampning. Dernæst indsamle 2D dyrkede celler ved at frigøre dem med trypsin, og derefter tilføje seks eller otte milliliter medium, der indeholder FBS. Inspirer cellerne med den 10 milliliter serologiske pipette, og aflejr dem i et 15 milliliter konisk rør.Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne. Forbered celleaffjedring i henhold til manuskriptanvisninger, og bland forsigtigt med pipetten for at sikre ensartet fordeling. Placer spidsen af pipetten i brønden i en vinkel på 45 grader og pipette 20 mikroliter af suspension i hver hængende dråbe godt.Placer låget af den seks-brønd plade tilbage på og bruge en elastisk termoplastisk strimmel til at forsegle kanterne. Inkuberes i en standard kuldioxid befugtet inkubator og fodre hængende dråber hver to til tre dage ved at tilføje to til tre mikroliter af cellekultur medium til hver sfæroid-holdige godt. For at kvantificere spredning og levedygtighed af cellerne, tilføje to mikroliter af filtreret resazurin-baseret opløsning til de brønde, der er udpeget til spredning analyse og inkubere i henhold til manuskript retning.Efter inkubationstiden skal du åbne den hængende dråbesandwich i et biosikkerhedsskab og bringe den 384 brøndplade med låget stadig på plads til pladelæseren. Læg den i pladelæseren, og læs pladen. Gem eksperimentet i pop op-vinduet, og eksportér dataene til et regneark.Sæt pladen tilbage til seks-brønds base og læg den i rugemaskinen. Når alle tidspunkter er blevet læst for dagen, skal pladen igen genindsendes, før den inkuberes. For at forberede sfæroider til flow cytometri analyse, bruge en 1000 mikroliter pipette til at indsamle dem fra hver brønd og deponere dem i en 15 milliliter konisk rør til opdeling.Aliquot celle suspension i fem mikro centrifuge rør, således at hvert rør indeholder mindst 50,000 celler. Centrifuge rørene ved 400 gange G i fem minutter i en mikrocentrifuge, derefter aspirere supernatant og re-suspendere pellets i 100 mikroliters af Aldefluor buffer. Mærl rørene i henhold til manuskriptanvisninger.Der tilsættes 0,5 mikroliter APC isotypeantistof til APC ISO-tuben og et mikroliter CD133-antistof til ALDH CD133-tuben. Derefter tilsættes fem mikroliter DEAB reagens og 0,5 mikroliter ALDH til DEAB-røret og en mikroliter ALDH til ALDH CD133-røret. Vortex alle rør i et par sekunder og inkubere dem ved 37 grader celsius i 45 minutter.Efter inkubationen, vortex alle rør igen og centrifuge dem på 400 gange G i fem minutter. Mærks FACS-rør i henhold til manuskriptanvisninger og fyld en isoleret skumbeholder med is. Inspirer supernatanten fra mikrocentrifugerørene.Derefter re-suspendere den uhæmmede kontrol i 400 mikroliter af FACS buffer og resten af cellerne i 400 mikroliter af FACS DAPI buffer. Placer rørene på isen, indtil de kan analyseres på et flow cytometer. Brug FlowJo til at analysere dataene fra flowcytometeret.Dobbeltklik på den ikke-tilbageholdte fil, og angiv Y-aksen til side scatter højde eller SSCH og X-aksen for at videresende punkthøjde eller FSCH. Klik på T-knappen ud for hver akse for at justere skalaen og maksimere adskillelsen mellem forskellige cellepopulationer. Klik derefter på polygongating-knappen, tegn polygonporten rundt om cellepopulationen, og mærk populationen Celler.Dobbeltklik på cellens population i arbejdsområdet, og skift derefter FSC-aksen til FSC-bredde og SSC-aksen til FSC-højden. Vælg rektangelporten for kun at tegne et rektangel rundt om cellernes venstre tætte population, der spænder over hele Y-aksen. Mærik denne port Enkelt celler.Højreklik derefter, og kopiér disse celler i porten med enkelte celler, og indsæt dem under hvert eksempel i arbejdsområdet. Dobbeltklik på porten Enkelt celler, der er indlejret under DAPI-prøven, for at få vist populationen med en enkelt celle fra det pågældende prøverør. Skift FSC-aksekanalen til DAPI-områdekanalen, og skift SSC-aksekanalen til histogram.Klik på T-knappen ud for DAPI-aksen, og klik på Tilpas akse for at justere skalaen og maksimere adskillelsen mellem DAPI positive og DAPI negative toppe. Klik på Anvend i pop op-vinduet, og vælg knappen Områdeport. Spred det over DAPI negative peak og mærke denne port Live Cells.Kopier porten til levende celler, og indsæt den under single cells-porten under APC ISO DEAB- og ALDH CD133-rørene for at vælge den samme del af levende celler i hvert rør. Dobbeltklik derefter på populationen Live Cells, der er indlejret under APC ISO-eksempelfilen, og skift X-aksen til ALDH-området og Y-aksen til APC-området. Anvend kvadrantporten, og juster skæringspunktet mellem porten, f.eks.Derefter navngive kvadranter som ønsket, derefter kopiere og indsætte kvadrant porte på levende celler befolkning indlejret under DEAB fil og justere den lodrette linje, således at ca 0,15% af cellepopulationen ligger inden for ALDH positive kvadrant. Endelig kopiere og indsætte kvadrant porte til ALDH CD133 filer Live Cells befolkning og evaluering kræft stamceller proportioner baseret på ALDH og CD133 proportioner. Denne protokol kan bruges til høj gennemløbsanalyse af patientafledte kræftstamceller.Så lidt som 10 celler per godt kan danne pålidelige sfæroider og som cellerne formere sig, spheroids udvide i størrelse. Spredningskapacitet kan let kvantificeres med en resazurin-baseret florescence assay. Virkningen af lægemidler på sfæroid morfologi kan visualiseres med fase kontrast billeddannelse og kvantificeres ved at sammenligne resazurin florescence i ubehandlede og behandlede celler.Celledød kan valideres ved tilsætning af Calcein-AM og ethidium homodimer I til sfæroider, efterfulgt af billeddannelse på et konfokal mikroskop. Endelig kan sfæroider høstes og spredes i en enkelt celler suspension til analyse med flow cytometri, hvilket gør det muligt at skelne effektiviteten af forskellige lægemiddelbehandlinger på specifikke cellepopulationer. For at undgå tab af dråber, medium fordampning og variation i sfæroid størrelse, er det vigtigt at håndtere dine plader omhyggeligt, pipette med præcision og helt forsegle dine hængende drop plader.For at evaluere ændringer i genekspression og opløselig signalering på grund af narkotikabehandling, enkelt celle RNA sekventering og enzym-forbundet immunosorbent assays, kan bruges til at lette udviklingen af terapeutiske. Denne teknik gør det muligt for forskning i onkologi, præcision medicin og udvikling af lægemidler til at udforske intra og inter patient heterogenitet samt kemo resistens gennem høj gennemløb lægemiddelscreening af små biopsier. Når du udfører denne protokol, skal du sørge for at bære alle standard personlige værnemidler.Herunder handsker, sikkerhedsbriller, laboratoriekitler, bukser og tæt-toed sko.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-afledt tumor explants som en "Live" præklinisk platform til forudsigelse af resistens hos patienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Udforskning af mitokondrieenergimetabolisme af enkelt 3D-mikrotissu-sfroider ved hjælp af ekstracellulær fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Pooled shRNA Library Screening for at identificere faktorer, der modulerer en lægemiddelresistensfænotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Generering af 3D-tumorsfæroider til lægemiddelevalueringsundersøgelser

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...