Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

本研究は、主にDOD OCRP早期キャリア研究者賞W81XWH-13-1-0134(GM)、DODパイロット賞W81XWH-16-1-0426(GM)、DOD研究者開始賞W81XWH-17-OCRP-IIRA(GM)、オバリアン癌とミシガン州のリブキンセンターによってサポートされています。同盟。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立衛生研究所の国立がん研究所によってサポートされました。CMNは、国立科学財団大学院研究フェローシップ第1256260号の支援を受けています。MEBは、国家ニーズ分野(GAANN)フェローシップの教育省大学院支援によって支援されています。

すべての患者サンプルは、同意患者から承認されたIRBプロトコルの下で収集され、そのサンプルは腫瘍の増分および腹水の採取後に識別解除される。
1. 384ウェルハンギングドロッププレートにおける小細胞数からのスフェロイドの生成
<ol><li>滅菌(DI)水で満たされたソニケーターに吊り下げドロッププレートを置き、20分間超音波処理します。</li>
	<li>手袋をした手で、?...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. 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B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening.">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture.">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

3Dスフェロイド形成のための384ウェルの吊り下げドロッププレートプラットフォームは、あらゆる細胞生物学または癌生物学研究室に簡単に実装されたツールです。この生理学的なプラットホームは高いスループットの薬物スクリーニングを可能にする間生理学的に関連する3D培養内の細胞株および主要な患者のサンプルの研究を可能にする。また、このプラットフォームは、培養条件が高度...

世界のがん関連死亡率は、2018年1月に980万人の死者を出し、改善された治療法の開発の必要性を強調した。残念ながら、がん治療薬の開発コストは増加しており、1つの薬剤の開発コストは約6億5,000万米ドル2であり、新しい抗がん剤を開発するための改善戦略の必要性を示しています。癌幹細胞(CSC)は、化学抵抗力3の増加を特徴とし、自己更新能力、および新しい腫瘍4を播種する能力が腫瘍再発4、転移5、および及び化学耐性4、6は、すべてが腫瘍の悪性容量に寄与し、したがって高い死亡者数に寄与する。卵巣癌では、これらの細胞は腹腔内の悪性腹水液中に濃縮され、臨床的結果の悪さに関連する状態である1.CSCの悪性化により、従来の化学療法と組み合わせて使用する新しいCSCターゲティング薬の開発が進められている。CSCターゲティング薬の開発に伴ういくつかの課題があります:1)インビトロでのCSCの拡大と維持の難しさ。2)患者サンプルの不足;3)培養プラットフォームの生理学的関連性;4)患者間の薬物感受性における不均一性。このプロトコルは、これらの課題を克服できる高スループット 3D カルチャ プラットフォームの実装について概説します。特に、このシステムは、少数の患者由来卵巣CSCを用いて迅速な薬物スクリーニングを可能にし、下流分析技術に非常に適しています。卵巣癌やCSCの研究に最適ですが、当社のプラットフォームは、複雑な3D環境で他の癌や分化細胞タイプを研究する上でも価値があります。
複雑な3次元(3D)モデルは、癌細胞、非癌支持細胞、および細胞外マトリックス(ECM)タンパク質からなる3Dニッチである腫瘍微小環境(TME)の研究において重要である4。この3D環境は、インビトロ4の従来の2D細胞培養と比較して、独自の細胞形態、細胞細胞および細胞マトリックス相互作用、細胞分化、細胞移動、細胞密度、および拡散勾配をもたらす。これらの要因のすべては、3D培養内の差動薬物応答で終わり、薬剤耐性および生理学的関連性の増加を示す7,8.CSC分化および化学耐性における3D TMEの役割のために、生理学的微小環境におけるCSCターゲティング薬のスクリーニングが不可欠です。CSC薬物スクリーニングプラットフォームの生理学的関連性の向上は、患者特異的な薬物スクリーニング、薬剤開発、治療戦略の処方、および最終的には臨床結果を改善する可能性を有する。医薬品スクリーニングに使用されるプラットフォームは、有望な薬剤のコスト、時間、および臨床翻訳時間を最小限に抑えるために、高スループットとダウンストリーム分析方法と互換性があることが同様に重要です9.
現在、複雑なTMEは、マウス合成腫瘍モデル、細胞株由来異種移植片、および患者由来異種移植片(PDX)モデル12などの生体内モデルを通じて薬物スクリーニングアプリケーションに最適です。条件。しかし、これらのモデルの低スループットの性質は、ならびに、彼らが必要とするコスト、時間、および技術的なスキルセットは、迅速かつ高スループットの薬物スクリーニングアプリケーション13でその有用性を制限する。生体内モデルでこれらに代わるものとして、ヒドロゲル8を利用した多くのインビトロ3Dモデル、マイクロ流体デバイス内の培養器10、14、および非付着培養3、8また、コスト、時間、必要なスキルセットの面で参入障壁が低いため、開発されています。
ヒドロゲル培養プラットフォームは、マトリックス組成、機械的特性、およびマトリックス構造15に対して与えられる微細な制御において有利である。しかしながら、それらは高密度細胞培養14を阻害することができる。さらに、ヒドロゲルからの細胞の採取は、収穫方法15の潜在的に有害な影響のために、下流分析を複雑にしうる。一方、マイクロ流体デバイスは、試薬の消費量を最小限に抑え、反応時間を短縮し、廃棄物を最小限に抑えながら、同じデバイス内および細胞培養を生理学的に関連するスケールで出力検出を可能にするマイクロスケールデバイスです。急速な拡散14.これらの特性は、薬物毒性、有効性、および薬物動態学を調査するための有望なプラットフォームを作ります。しかし、効率的、定量化可能、再現性、およびユーザーフレンドリーな3D細胞培養の課題、ならびにかさばる高価なポンプシステムは、ハイスループット研究10におけるマイクロ流体アプリケーションを制限しています。また、効率的な検出設定と、分野を越えた実装が困難になる可能性もあり、マイクロ流体システム10の広範な採用を妨げている。
逆に、回転ミキサー(nutators)、超低アタッチメントプレート、および吊り下げ液滴の非付着状態で生成されたスフェロイドは、ユーザ定義のマトリックス成分を含まない。これらの方法論は、非付着性条件が精片腔内でスフェロイドが成長する条件の代表であるとして、卵巣癌の研究に特に関連する5.これらの非付着性培養法の中で、ヌタレータおよびぶら下げドロップスフェロイドは、超低アタッチメントプレートで生成されたスフェロイドと比較して、より高い圧縮、改造、および化学抵抗を示することが示されており、生理学的な増加を示唆している。関連性16,17,18,19.より小さい井戸サイズおよび最低の必要な細胞数からのハイスループットスクリーニングのための容量の増加のために、吊り下げドロッププレートの球体生成は薬物スクリーニングのための理想的なプラットホームである。ここでは、実装が容易で、下流分析に非常に適した384ウェルの吊り下げドロッププレートで、卵巣癌および卵巣CSCの高スループット薬物スクリーニングに最適な、384ウェルの吊り下げドロッププレートでの整合可能な3D生理学的プラットフォームを提示します。
当社の3D生理学的プラットフォームは、生理細胞接点、拡散勾配、細胞密度、および自然に産生されるECMタンパク質を含む3D培養のすべての利点を提供し、現実的な薬物応答に寄与する可能性がある16、 17,18,19.さらに、患者由来のCSCでこれらのスフェロイドを生成することにより、多くの技術的反復を同時に行う薬物1に対する患者特異的応答を決定し、患者腫瘍内で見られる可能性のある不均一性を克服することができる。サンプル20.さらに、3D培養はCSC集団3、16の維持を強化することが示されており、従って腹水7における濃縮CSC集団の代表である。これにより、生存率のフローサイトメトリー分析やCSCプロポーションを含む下流分析が容易になり、CSCターゲティング薬効効の最適な評価が可能になります。最後に、この生理学的プラットフォームは、実験中の複数の時点でのイメージング、細胞死と増殖の評価、免疫組織化学による細胞組織および形態、ELISAによる可溶性シグナル伝達と互換性があります。培地、フローサイトメトリーを有する細胞表現型、およびPCRに続く遺伝子発現。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

このプロトコルでは、生理的に代表的な微小環境における抗癌治療のハイスループットスクリーニングを可能にするために、384ウェルの吊り下げ液滴内で腫瘍スフェロイドを生成するための手順を概説する。患者由来のがん幹細胞スフェロイドの形成と、薬物治療後の徹底的な分析のためのこれらのスフェロイドの操作について概説する。具体的には、スフェロイド形態、増殖、生存率、薬物毒性、細胞表現型および細胞局在化データの収集について説明する。このプロトコルは、384ウェル吊り下げプラットフォームを使用して簡単に実装できる分析技術に重点を置き、高スループットの薬物スクリーニングに最適です。卵巣癌研究やがん幹細胞研究においてこのモデルの重要性を強調する一方で、384-wellプラットフォームは他のがんタイプや疾患モデルの研究に適しており、プラットフォームの有用性を多くの分野に広げています。生理学的に代表的な3D培養を容易に実施することで、個別化された薬物スクリーニングのスピードとスクリーニング結果の質を向上させることで、新しい治療薬や患者特異的な治療法の開発に役立てることを予測されます。治療戦略は、したがって、広範囲の臨床影響を持っています。

細胞株または患者由来CSCで形成されたスフェロイドは、吊り下げ液滴内の小さな細胞数の範囲で形成することができる(図2A)。スフェロイドは、ウェルあたりわずか10個の細胞で確実に形成され、希少な患者サンプルの保存が可能です。これらのスフェロイド内の細胞は、生体内と同様に3次元で他の細胞に囲まれ、生理細胞接触と拡散速度を可能にします。スフェロイド...

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

当社のプロトコルは、3D細胞培養のための簡単な方法を提供し、下流の分析に非常に適しています。これにより、異機種患者サンプルおよびその特定の薬剤応答の評価が容易になります。この技術の利点は、スフェロイドが小さな細胞数から形成され、希少な一次サンプルの保存と患者固有の薬物応答のための高スループットスクリーニングの両方を可能にできることである。吊り下げ低下モデルは、3D薬物拡散を伴う生理学的環境を作り出し、腫瘍段階に対応する応答を行う。これにより、標的療法および患者固有の治療法の開発が可能になります。この方法は、卵巣癌、異種性および化学抵抗性の発達を研究するのに理想的である。しかし, 他の癌や薬剤耐性細胞集団を研究するために使用することもできます。.スフェロイドをめっきする場合、正確な体積をピペットすることが重要です。これにより、回転楕円体間の一貫性が確保されます。スフェロイドとそれぞれの液滴は本質的に壊れやすく、適切な取り扱いなしに失われやすいので、吊り下げドロッププレートを適切にプレート、維持、分析する方法を示します。この手順を実証するマイケル・ブレゲンザー、私たちの研究室の大学院生です。6ウェルプレートの各井戸に4〜5ミリリットルのオートクレーブ脱イオン水を充填し、蓋とプレートの底の間に吊り下げドロッププレートを挟みます。吊り下げドロッププレートの縁の周りに800〜1000マイクロリットルの水を加え、湿気の多い環境を提供し、蒸発を最小限に抑えます。次に、2D成長細胞をトリプシンで取り外し、FBSを含む培地を6〜8ミリリットル加えて回収する。細胞を10ミリリットルの血清ピペットで吸引し、15ミリリットルの円錐管に沈着させる。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。原稿の方向に従って細胞懸濁液を調製し、ピペットと穏やかに混ぜて均質な分布を確保します。ピペットの先端を45度の角度でウェルに置き、ピペット20マイクロリットルの懸濁液を各吊り下げドロップウェルに入れる。6ウェルプレートの蓋を元に戻し、伸縮性のある熱可塑性ストリップを使用してエッジを密封します。標準的な二酸化炭素加湿インキュベーターにインキュベートし、各スフェロイド含有ウェルに2〜3マイクロリットルの細胞培養培地を加えることによって2〜3日ごとに吊り下げ滴を供給する。細胞の増殖と生存率を定量化するために、増殖分析のために指定されたウェルに2マイクロリットルのろ過レサズリンベースの溶液を加え、原稿の方向に従ってインキュベートする。インキュベーション期間の後、ハンギングドロップサンドイッチをバイオセーフティキャビネットに開き、蓋を残した384ウェルプレートをプレートリーダーに持って行きます。プレートリーダーに入れ、プレートを読みます。テストをポップアップ ウィンドウに保存し、データをスプレッドシートにエクスポートします。プレートを6ウェルベースに戻し、インキュベーターに入れます。すべての時間ポイントが一日読み取られたら、インキュベートする前にプレートを再シールします。フローサイトメトリー分析のためにスフェロイドを調製するには、1000マイクロリットルピペットを使用して各ウェルからそれらを収集し、分解のために15ミリリットル円錐形チューブに堆積させます。アリコート細胞は5つのマイクロ遠心チューブに懸濁し、各チューブが少なくとも50,000個の細胞を含む。マイクロ遠心分離機でチューブを400倍Gで5分間遠心し、上清を吸引し、100マイクロリットルのアルデフルオールバッファーでペレットを再懸濁します。原稿の指示に従ってチューブにラベルを付けます。APC ISOチューブに0.5マイクロリットルのAPCアイソタイプ抗体を加え、CD133抗体を1マイクロリットルずつALDH CD133チューブに加えます。次に、DEAB試薬5マイクロリットルとALDHの0.5マイクロリットルをDEABチューブに加え、ALDHの1マイクロリットルをALDH CD133チューブに加えます。数秒間すべてのチューブをボルテックスし、45分間摂氏37度でそれらをインキュベートします。インキュベーション後、すべてのチューブを再び渦巻きし、5分間Gの400倍に遠心分離する。原稿の方向に従ってFACSチューブにラベルを付け、断熱発泡容器を氷で満たします。マイクロ遠心チューブから上清を吸引する。次に、FACSバッファーの400マイクロリットルで未染色制御を再中断し、残りの細胞を400マイクロリットルのFACS DAPIバッファーに再中断します。チューブを氷の上に置き、フローサイトメーターで分析できます。FlowJo を使用して、フローサイトメーターからのデータを分析します。未染色ファイルをダブルクリックし、Y 軸を横のスキャッタ高さに設定するか、または SSCH 軸を、X 軸を前方の拡散高さまたは FSCH に設定します。各軸の横にある T ボタンをクリックして、スケールを調整し、異なるセルの母集団間の分離を最大化します。次に、[ポリゴン ゲート] ボタンをクリックし、セルの母集団の周囲にポリゴン ゲートを描画し、人口セルにラベルを付けます。ワークスペースでセルの母集団をダブルクリックし、FSC 軸を FSC 幅に、SSC 軸を FSC の高さに変更します。四角形のゲートを選択すると、Y 軸全体にまたがって、最も左の密度の高いセルの母集団の周囲にのみ四角形が描画されます。このゲートに単一セルにラベルを付けます。次に、ネストされた単一セルのゲートで、このセルを右クリックしてコピーし、ワークスペース内の各サンプルの下に貼り付けます。DAPI サンプルの下にネストされた単一セルのゲートをダブルクリックすると、そのサンプル チューブから単一セルの母集団が表示されます。FSC 軸チャネルを DAPI エリア チャネルに変更し、SSC 軸チャネルをヒストグラムに変更します。DAPI 軸の横にある T ボタンをクリックし、[軸のカスタマイズ] をクリックしてスケールを調整し、DAPI 正と DAPI の負のピークの間の分離を最大化します。ポップアップウィンドウで[適用]をクリックし、[範囲ゲート]ボタンを選択します。DAPI負のピークに広げ、このゲートライブセルにラベルを付けます。ライブセルゲートをコピーし、APC ISO DEABおよびALDH CD133チューブの下の単一セルゲートの下に貼り付け、各チューブ内の生細胞の同じ部分を選択します。次に、APC ISO サンプル ファイルの下にネストされたライブ セルの作成をダブルクリックし、X 軸を ALDH 領域に、Y 軸を APC 領域に切り替えます。[象限ゲート]を適用し、母集団の約0.5%がプロットウィンドウの左上にあるなどのゲートの交点を調整します。次に、必要に応じて象限に名前を付け、DEAB ファイルの下にネストされたライブ セルの母集団に象限ゲートをコピーして貼り付け、セルの母集団の約 0.15% が ALDH 正象限内に収まるように垂直線を調整します。最後に、ALDH CD133ファイルに四分の一のゲートをコピーして貼り付け、ALDHとCD133プロポーションに基づいて癌幹細胞の割合を評価するライブ細胞集団を。このプロトコルは患者由来の癌幹細胞の高い効率分析のために使用することができる。ウェルあたりわずか10個の細胞が信頼性の高いスフェロイドを形成することができ、細胞が増殖するにつれて、スフェロイドのサイズが拡大します。増殖能力は、レサズリン系の蛍光アッセイで容易に定量することができる。スフェロイド形態に対する薬物の効果は、位相コントラスト画像化で可視化し、未処理および治療された細胞における再サズリンの蛍光を比較することによって定量化することができる。細胞死は、カルセインAMおよびエチジウムホモジマーIをスフェロイドに添加し、続いて共焦点顕微鏡でイメージングすることによって検証することができる。最後に、スフェロイドを採取し、フローサイトメトリーで分析するために単一の細胞懸濁液に分散することができ、特定の細胞集団に対する異なる薬物治療の有効性を識別することが可能になる。液滴の損失、中程度の蒸発、スフェロイドサイズの変動を避けるためには、プレートを慎重に処理し、ピペットを正確に処理し、吊り下げドロッププレートを完全に密封することが重要です。薬物治療による遺伝子発現および可溶性シグナル伝達の変化を評価するために、単細胞RNAシーケンシングおよび酵素結合免疫吸着アッセイは、治療薬の開発を容易にするために使用することができる。この技術により、腫瘍学、精密医療、医薬品開発の研究は、小さな生検の高スループット薬物スクリーニングを通じて、患者の異質性と患者間の不均一性と共に化学抵抗性を探求することができます。このプロトコルを実行する場合は、すべての標準的な個人用保護具を着用してください。手袋、安全メガネ、ラボコート、ズボン、近い靴を含む。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

がん研究

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...