Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

نشكر جوناثان رودنفيلز، كازيميرز تكوفسكي، ويوهانا ب. ويذرز على المشورة بشأن تحليل البيانات. كما نشكر ج. هايوارد على الأجسام المضادة لـ SSB. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة T32GM007223 وT32AI055403 من المعاهد الوطنية للصحة (إلى TKV) ومنحة NIH (CA16038) (إلى JAS). JAS هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم استنساخ الأشكال 1-3 والجدول 1 بإذن من الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة بموجب ترخيص إسناد المشاع الإبداعي من المنشور التالي: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated يتأثر تراكم فيروس الهربس في البؤر النووية بالنسخ المتماثل للحمض النووي الفيروسي والحمض النووي النووي المتعدد الشفرة غير الشفرة الفيروسية. مجلة علم الفيروسات. 92 (13)، دوي: 10.1128/JVI.00220-18، (2018).

1. تصميم الفلورة في الموقع (FISH) المضادة للحاسة oligonucleotides للكشف عن نسخة محددة من الهربس الفيروسي
<ol><li>حدد 25 إلى 40 NT شرائح من تسلسل RNA من الفائدة وتحويل هاهية الإحساس. قد تحتوي استراتيجية FISH الناجحة من واحد إلى عشرة أو أكثر مختلفة المضادة للحاسة oligonucleotides. عند تحديد تسلسلات، خذ بعين الاعتبار ما ?...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production.">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).</li><li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

يمكن تكييف البروتوكول الموضح في هذا التقرير مع أنواع الخلايا المختلفة ويتضمن خطوات لسمك RNA وRNA FISH المزدوج مع IF باستخدام الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة ومتعددة النسيلة. على الرغم من أن الشرائح المعدة عادة ما يتم تصويرها مع المجهر البؤري، يمكن إجراء التصوير مع مجهر STED (استنفاد الانب...

في المرحلة اللاإحتيابية (النشطة)، تخطف فيروسات الهربس الخلية المضيفة، مما يسبب تغييرات في مورفولوجيا الخلايا وتوطين الجزيئات البيولوجية، لإنتاج الفيرونات. قاعدة العمليات هي النواة، حيث يتم تكرار الجينوم الفيروسي الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل وتعبئتها في قذيفة بروتين، ودعا كابسيد1. للبدء، يعبر الفيروس عن بروتيناته الخاصة، واختطاف الآلات المضيفة ومنع التعبير عن الجينات المضيفة غير الأساسية، وهي عملية تسمى تأثير إيقاف المضيف. يتم ترجمة غالبية هذا النشاط إلى محددة 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI)-المناطق النووية الخالية من تسمى مقصورات النسخ المتماثل الفيروسي, تتألف من كل من البروتينات المضيفة والفيروسية, RNAs, والحمض النووي الفيروسي2. يتم إصلاح الخلية لتوفير مساحة وموارد لمقصورات النسخ المتماثل وبالتالي تجميع الغطاء الفيروسي. بمجرد خروج الكابسيد من النواة، فإن كيفية تغليف الكابسيد في السيتوبلازم لإنتاج جسيمات فيروسية مرتبطة بالغشاء، والمعروفة أيضًا باسم فيريون، غير واضحة. فهم التوطين والتحولات المكانية لكل من الجزيئات الحيوية المضيفة والفيروسية خلال المرحلة اللائوية يوفر رؤية ميكانيكية أعمق في ترتيب مقصورة النسخ المتماثل، وتأثير إيقاف المضيف، ومسار خروج الفيرون، وغيرها العمليات المتعلقة بالعدوى الفيروسية الهربسية والنسخ المتماثل.
حاليا أفضل طريقة للكشف عن ودراسة هذه التغييرات هو التصور من البروتينات وRNAs في الخلايا المصابة مع الفلورة المناعية (IF) والهجين الفلورسنت في الموقع (FISH)، على التوالي. استخدام مسار زمني مع هذه التقنيات يكشف عن توطين الجزيئات الحيوية في النقاط الرئيسية للمرحلة اللاتيك أو ببساطة، البيانات spatiotemporal. FISH وIF تكمل التقنيات البيوكيميائية الأخرى، مثل تثبيط عملية الخلوية (على سبيل المثال، تثبيط النسخ المتماثل الحمض النووي الفيروسي)، RT-qPCR (تفاعل البوليميراز سلسلة في الوقت الحقيقي)، تسلسل الحمض النووي الريبي، البقع الشمالية، الطيف الكتلي، النشاف الغربي، و تحليل إنتاج الحمض النووي الفيروسي، التي قد توفر صورة أكثر عالمية للأنشطة الخلوية.
قمنا بتطوير استراتيجيات الحمض النووي الريبي FISH لفحص منتجات الحمض النووي الريبي من جينات محددة وتحليل حسابي يحسب كميا نسبة النيوكليوسيتوبلازميك لمنتج جين معين. إعداد عينة, تعديلها من المنشورات السابقة من قبل Steitz والزملاء3,4, من السهل نسبيا ويمكن استخدامها لكل من الخلايا الملتصقة والمعلقة. البروتوكول أيضا قابل للتكيف للاستخدام المتزامن لاستراتيجيات الأسماك RNA متعددة (مزدوجة RNA FISH) أو RNA FISH مع استراتيجيات IF. إن وضع استراتيجية محددة للأسماك والأسماك أمر ينطوي على تحديات، ولكن الاقتراحات الرامية إلى تحسين النجاح مبينة. تحليل البيانات الموضحهنا هو كمية إذا تم استخدام الخرز الفلورسنت وعلامات قوية من حدود المقصورة ويقدم نظرة ثاقبة إضافية في الميكروغراف، البصيرة التي تزيل التحيز الملاحظة. تم تصميم البروتوكول المفصل لكل من الخلايا الكامنة والليسية المصابة بفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي (KSHV) ويمكن استخدامه مع الخلايا أو الخلايا غير المصابة بفيروسات الهربس الأخرى5. وتنطبق أساليب التكميم على الدراسات المتعلقة بالتحولات النووية أو إعادة التوطين بين المقصورات دون الخلوية في معظم الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

البصيرة الميكانيكية تصل من دراسة متأنية والقياس الكمي لRNAs محددة والبروتينات. يمكن التقاط المواقع النسبية لهذه الجزيئات الحيوية في جميع أنحاء الخلية في أوقات محددة مع الفلورة في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF). أثناء عدوى فيروس الهربس الليتيك، يخطف الفيروس الخلية المضيفة للتعبير بشكل تفضيلي عن الجينات الفيروسية، مما يسبب تغييرات في مورفولوجيا الخلايا وسلوك الجزيئات الحيوية. وتتركز أنشطة اللتيك في المصانع النووية، وتسمى مقصورات النسخ المتماثل الفيروسي، والتي يمكن تمييزها فقط مع FISH وIF. هنا نقوم بوصف بروتوكول قابل للتكيف من الحمض النووي الريبي FISH وتقنيات IF لفيروس الهربس المرتبطبة بساركوما كابوسي (KSHV) الخلايا المصابة، على حد سواء الالتزام وتعليق. وتشمل الطريقة خطوات لتطوير oligonucleotides المضادة للشعور محددة، مزدوجة الحمض النووي الريبي الأسماك، RNA FISH مع IF، والحسابات الكمية من كثافة الفلورة. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على أنواع الخلايا المتعددة، والخلايا غير المصابة، والخلايا الكامنة، والخلايا اللاتيكية، والدورات الزمنية، والخلايا المعالجة بمثبطات لتحليل الأنشطة الصدغية لـ RNAs محددة والبروتينات من كل من المضيف البشري و KSHV.

وترد أساليب FISH وIF المفصلة في هذه المخطوطة في الشكل 1 جنبا إلى جنب مع التحديد الكمي للنتائج من خلال آثار خط شدة الفلورسنت. النتائج المعروضة هنا شبه كمية وتقدم نظرة ثاقبة في التوطين، بدلا من المقارنات بين كثافة من البقع الفلورية المختلفة لأن التجارب لم تشمل ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

نحن نصف بروتوكول باستخدام الفلورة في الموقع التهجين (FISH) لتصور RNAs الهربس الفيروسي متعددة داخل الخلايا البشرية المصابة lytically، إما في تعليق أو التمسك. يتضمن هذا البروتوكول تحديد كمية الفلورة التي تنتج نسبة النيوكليوسيتوبلازمية ويمكن تمديدها للتصور المتزامن للبروتينات المضيفة والفيروسية ذات الفلورة المناعية (IF).

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

البروتوكول مفيد للحصول على نظرة كمية في التنظيم الزمني للمنتجات الجينية الفيروسية ، في سياق الخلايا المضيفة ، وخاصة فيما يتعلق بفيروسات الهربس. يمكن أن تساعد هذه التقنية في معالجة أسئلة البحث المتعلقة بكل من الرنا والفيروسات والبروتينات. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية متوافق مع الميكاويات الحيوية المتزامنة.للتمسك الخلايا إلى ثمانية شرائح غرفة، وتطبيق 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المتأصلة لكل غرفة من شريحة معقمة، ثمانية غرف والسماح بنمو البذور لمدة 12-24 ساعة، في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، pirate الخلايا السوبر وغير مرتبط، وعلى الفور إصلاح الخلايا مع ما قبل المبردة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني على الجليد، لمدة 30 دقيقة. في نهاية التثبيت، وغسل الخلايا مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في 200 ميكرولترات من 4 درجة مئوية PBS لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، permeabilize الخلايا الثابتة مع 200 ميكرولترات من قبل المبردة 0.5٪ تريتون X في برنامج تلفزيوني في البئر، لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية permeabilization، وإزالة بعناية الغرف دون تكسير الشريحة، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا. كتلة الخلايا المشطفة مع ما قبل مبردة 4٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية بوليكلان المناسبة من الفائدة في 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة، في أربع درجات مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد واحتضان الخلايا مع جسم مضاد الثانوية المناسبة المقترنة مع الفلوروفوري متوافق مع الجسم المضاد الكشف FISH لمدة ساعة واحدة، في أربع درجات مئوية. بعد ثلاثة PBS يغسل كما هو موضح، إصلاح العينات مرة أخرى في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة قبل permeablization الثانية كما هو موضح. ثم تغطية الشريحة مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على إشارة الفلورسنت ومنع photobleaching.وغسل الخلايا مع 2x سيلت الصوديوم المالحة، قبل تطبيق 45 ميكرولترات من محلول التهجين. بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة، إضافة الماء المقطر إلى oligonucleotides المضادة للانخصاج من الفائدة لتحقيق حجم denaturation إلى 10 ميكرولترات. اضمر oligonucleotides في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، قبل إضافة 35 ميكرولترات من حل التهجين الطازجة في الشريحة الواحدة.ثم احتضان العينات من 10-24 ساعة في غرفة مرطبة في 37 درجة مئوية، محمية مع احباط. في اليوم التالي، اغسل الزنزانات بـ 2 أو 10 دقائق. 2X سترات الصوديوم المالحة يغسل في درجة حرارة الغرفة، تليها غسل واحد في 1X سترات الصوديوم المالحة لمدة 10 دقائق، في 25 درجة مئوية.بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، لمدة 10-15 دقيقة على الجليد، تليها ثلاثة يغسل مع PBS الطازجة. المقبل، permeabilize العينات كما هو موضح، تليها الحضانة مع FTC المضادة للديووجينين و0.1٪ BSA قبل المبردة في برنامج تلفزيوني، لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في مقسم جديدة، وإصلاح العينات مع ما قبل مبردة 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني، لمدة 10-15 دقيقة في أربع درجات مئوية.بعد ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني، وتسمية النوى مع 0.4 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI و0.5٪ المبردة قبل تريتون X في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة على الجليد، تليها ثلاثة يغسل النهائي في برنامج تلفزيوني. جبل الشرائح مع الخرز الفلورسنت، كما ذات الصلة تجريبيا وفي المتوسطة المناسبة تصاعد. بعد إزالة زيادة المتوسطة تصاعد مع مناديل معقمة، وختم واحد coverslip لكل شريحة مع معاطف متعددة من طلاء الأظافر واضحة، واستخدام المجهر الفلورسنت لتأكيد التنفيذ الناجح للتجربة.ويمكن بعد ذلك التقاط الصور على مجهر confocal لجمع الصور من العينات في غضون ساعة إلى أسبوع من تصاعد، في 630 مرة التكبير. هذه الأسماك التمثيلية ونتائج الفلوروسينت شبه بيانية وتقدم نظرة ثاقبة في توطين أوليغونوكليوتيد ، بدلاً من المقارنة بين كثافة البقع الفلورية المختلفة ، لأن هذه التجارب لم تتضمن حبة فلورية في إعداد الشريحة. في هذه التجارب، كانت المناطق السيتوبلازمية والنووية ونسبها مختلفة للخلايا المصابة KSHV الكامنة واللائية.وكما هو موضح في هذا الشكل، يتم التحكم في المنطقة في نسبة النوبات. عندما يتم تثبيط تكرار الحمض النووي KSHV في المرحلة اللبية ، يتحول البروتين الزلي المبكر من نسخة KSHV oligonucleotide إلى تعريب cytoplasmic في الغالب. KSHV الحمض النووي الريبي polyadenylated، ومع ذلك، تعريب إلى مواقع نووية محددة على الرغم من تثبيط تكرار الحمض النووي الفيروسي.عند إزالة الغرف من الشرائح، والحرص على أن هناك بقايا لاصقة قليلة جدا على الأداة، واستخدام الإيثانول لblmeablize الخلايا وإضعاف لاصقة. يمكن إجراء الميكيميات الحيوية مثل QPCR، واللطخة الغربية، وتسلسل الإنتاجية العالية، جنبا إلى جنب لزيادة البيانات الكمية التي تم جمعها من micrographs.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان في الموقع التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

تهجين<em&gt; في الموقع</em&gt; من الغدد اللعابية والمبيض والأجنة من البعوض الحامل للمرض

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

فلوري<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين على الكروموسومات الميتوزى من البعوض

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...