Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Vi takker Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski og Johanna B. Withers for rådgivning om dataanalyse. Vi takker også G. Hayward for anti-SSB antistof. Dette arbejde blev støttet af tilskud T32GM007223 og T32AI055403 fra National Institutes of Health (to TKV) og NIH Grant (CA16038) (til JAS). JAS er undersøger af Howard Hughes Medical Institute. Figur 1-3 og tabel 1 blev gengivet med tilladelse fra American Society for Microbiology under en Creative Commons Attribution-licens fra følgende publikation: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposis sarkom-associeret Herpes virus mRNA ophobning i nukleare Foci er påvirket af viral DNA-replikation og viral Noncoding Polyadenyleret nukleare RNA. Tidsskrift for virologi. 92 (13), Doi: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).

1. design af fluorescens in situ (FISH) antisense-oligonukleotider til påvisning af en specifik herpesviral udskrift
<ol><li>Vælg 25 til 40 NT segmenter fra sekvensen af RNA af interesse og konverter til at være anti-sense. En vellykket fisk strategi kan indeholde fra en op til ti eller flere forskellige anti-sense oligonukleotider. Overvej følgende, når du vælger sekvenser:<ol>
<li>Hvis RNA af interesse indeholder en unik gentagelse region, derefter udnytte denne funktion og designe en anti-sense oligonukleotid ...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production.">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).</li><li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, kan tilpasses til forskellige celletyper og omfatter trin for dobbelt RNA-fisk og RNA-fisk med ved brug af både monoklonale og polyklonale primære antistoffer. Selvom forberedte slides typisk er afbildet med et konfokalt mikroskop, kan billeddannelse udføres med et STED (stimuleret udlednings udtynding) mikroskop efter ændringer af øget antistofkoncentration og et andet monterings medium. For øget analyse af individuelle celler, kan prøver udarbejdet med denne protok...

I deres lytisk (aktiv) fase, herpesvira kapre værtscellen, forårsager ændringer i celle morfologi og lokalisering af biologiske molekyler, at producere virions. Basen af operationer er kernen, hvor det dobbeltstrengede DNA-virale genom replikeres og pakkes ind i en proteinshell, kaldet et kapsid1. Til at begynde, virussen udtrykker sine egne proteiner, kapring værts maskiner og forhindre udtryk for ikke-væsentlige vært gener, en proces kaldet Host afspærring effekt. Størstedelen af denne aktivitet er lokaliseret til specifikke 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-fri nukleare regioner kaldet viral replikation rum, bestående af både vært og virale proteiner, RNAs, og viral DNA2. Cellen er overhalet for at give plads og ressourcer til replikeringsrum og dermed samling af virale capsid'er. Når kapsid forlader kernen, hvordan kapsid er indhyllet i cytoplasmaet at producere en membran-bundet viral partikel, også kendt som en virion, er uklar. Forståelse af lokalisering og rumlige forskydninger af både Host og viral biomolekyler i den lytiske fase giver dybere mekanistisk indsigt i arrangementet af replikeringsrum, Host afspærring effekt, virion-egress pathway og andre processer relateret til herpesviral infektion og replikation.
I øjeblikket den bedste metode til at opdage og studere disse ændringer er visualisering af proteiner og RNAs i inficerede celler med immunofluorescens (IF) og fluorescerende in situ hybridisering (fisk), hhv. Brug af et tidsforløb med disse teknikker afslører lokalisering af biomolekyler på centrale punkter i den lytiske fase eller blot, spatiotemporale data. FISK, og hvis supplere andre biokemiske teknikker, såsom hæmning af en cellulær proces (f. eks hæmning af viral DNA-replikation), RT-qPCR (real-time polymerase kædereaktion), RNA sekventering, nordlige blots, massespektrometri, vestlige blotting, og analyse af viral DNA-produktion, der kan give et mere globalt billede af cellulære aktiviteter.
Vi udviklede RNA-fiske strategier for at undersøge RNA-produkterne fra specifikke gener og en beregningsmæssige analyse, der kvantitativt beregner nukleocytoplasmic-forholdet for et bestemt genprodukt. Prøveforberedelsen, modificeret fra tidligere udgivelser af Steitz og kolleger3,4, er relativt let og kan bruges til både overtrædende og suspenderede celler. Protokollen kan også tilpasses til samtidig brug af flere RNA-fiske strategier (dobbelt RNA-fisk) eller RNA-fisk med IF-strategier. Udvikling af en specifik fiske strategi er udfordrende, men der skitseres forslag til forbedring af succes. Den dataanalyse, der er beskrevet her, er kvantitativ, hvis fluorescerende perler og stærke markører for rum grænser anvendes og giver yderligere indsigt i mikrografer, indsigt, som fjerner observation bias. Den detaljerede protokol er designet til både latente og lytiske celler inficeret med Kaposis sarkom-associeret herpes virus (KSHV) og kan bruges med ikke-inficerede celler eller celler inficeret med andre herpesvira5. Metoderne til kvantitation gælder for undersøgelser af nukleocytoplasmiske forskydninger eller udflytning mellem subcellulære rum i de fleste celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

Mekanistisk indsigt kommer fra omhyggelig undersøgelse og kvantificering af specifikke RNAs og proteiner. De relative placeringer af disse biomolekyler i hele cellen på bestemte tidspunkter kan fanges med fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF). Under lytisk herpes virus infektion, virussen kaprer værtscellen til fortrinsvis udtrykke virale gener, forårsager ændringer i cellernes morfologi og opførsel af biomolekyler. Lytiske aktiviteter er centreret i nukleare fabrikker, betegnet viral replikation rum, som kun kan skelne med fisk og hvis. Her beskriver vi en tilpasningsdygtig protokol af RNA fisk og hvis teknikker til Kaposis sarkom-associerede herpes virus (KSHV)-inficerede celler, både overholder og i suspension. Metoden omfatter trin til udvikling af specifikke anti-sense-oligonukleotider, dobbelt RNA-fisk, RNA-fisk med IF og kvantitative beregninger af fluorescens intensiteter. Denne protokol er blevet anvendt med succes på flere celletyper, ikke-inficerede celler, latente celler, lytiske celler, tids kurser og celler behandlet med hæmmere til at analysere de spatiotemporale aktiviteter af specifikke RNAs og proteiner fra både den menneskelige vært og KSHV.

FISKENE og de metoder, der er beskrevet i dette manuskript, er vist i figur 1 sammen med kvantificeringen af resultaterne ved hjælp af linje spor af fluorescerende intensitet. Resultaterne præsenteres her er semi-kvantitative og giver indsigt i lokalisering, snarere end i sammenligninger mellem intensiteter af forskellige fluorescerende pletter, fordi eksperimenter ikke omfatter en fluorescerende perle i slide forberedelse. Figur 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Vi beskriver en protokol, der udnytter fluorescens in situ-hybridisering (FISH) til at visualisere flere herpes viral RNAs i lytisk inficerede humane celler, enten i suspension eller overholder. Denne protokol omfatter kvantificering af fluorescens, der producerer et nukleocytoplasmic-forhold, og kan udvides til samtidig visualisering af værts-og virale proteiner med immunofluorescens (IF).

Kvantitativ fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF) af specifikke genprodukter i KSHV-inficerede celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Protokollen er nyttig for at få kvantitativ indsigt i den tidsmæssige regulering af virale genprodukter, inden for rammerne af værtsceller, især i forhold til herpes virus. Denne teknik kan hjælpe med at løse forskningsspørgsmål i forbindelse med både vært og virale RNA'er og proteiner. Desuden er denne teknik kompatibel med samtidige biokemiske analyser.At holde cellerne til otte kammer dias, anvende 200 mikroliter af en iboende celle suspension til hvert kammer af en steril, otte chambered dias og tillade frø vækst i 12-24 timer, ved 37 grader Celsius, og 5% kuldioxid. Ved slutningen af inkubationen, aspirere supernatant og løsgængere celler, og straks fastsætte cellerne med forkølet 4% formaldehyd i PBS på is, i 30 minutter. Ved afslutningen af fikseringen vaskes cellerne med tre, fem minutters vaske i 200 mikroliter på 4 grader Celsius PBS pr. vask.Efter den sidste vask, permeabilize de faste celler med 200 mikroliter af forkølet 0,5% Triton-X i PBS pr brønd, i 10 minutter på is. Ved afslutningen af permeabiliseringen fjernes kamrene forsigtigt uden at revne diaset, og cellerne skylles med forkølet PBS. De skyllede celler blokeres med forkølet 4%BSA i PBS i 30 minutter ved fire grader Celsius efterfulgt af inkubation med passende polyklonalt primært antistof af interesse i 0,1% BSA i PBS i en time ved fire grader Celsius.Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne tre gange med frisk PBS, og cellerne inkuberes med et passende sekundært antistof, der er konjugeret med et fluorisk kompatibelt med detektering af akvariet i en time ved fire grader Celsius. Efter tre PBS vasker som påvist, fastgør prøverne igen i 4% formaldehyd i PBS i 10-15 minutter før en anden permeablization som påvist. Dæk derefter diaset med aluminiumsfolie for at bevare fluorescerende signal og forhindre fotobleaching.Og vask cellerne med 2x saltvandsnatriumcitrat, før du anvender 45 mikroliter hybridiseringsopløsning. Efter en time ved 37 grader Celsius i et befugtet kammer, tilsæt destilleret vand til antisense oligonukleotider af interesse for at bringe denaturering volumen til 10 mikroliter. Denature oligonukleotides ved 95 grader Celsius i fem minutter, før du tilføjer 35 mikroliter frisk hybridiseringsløsning pr. dias.Derefter inkubere prøverne fra 10-24 timer i befugtet kammer ved 37 grader Celsius, beskyttet med folie. Den næste dag, vaske cellerne med to, 10 minutter. 2X saltvandsnatriumcitrat vaskes ved stuetemperatur, efterfulgt af en vask i 1X saltvand natriumcitrat i 10 minutter, ved 25 grader Celsius.Efter den sidste vask fastgøres cellerne med forkølet 4% formaldehyd i PBS i 10-15 minutter på is efterfulgt af tre vaske med frisk PBS. Dernæst permeabilize prøverne som påvist, efterfulgt af inkubation med anti-dioxigenin FTC og pre-kølet 0,1% BSA i PBS, for en time ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes objektglassene tre gange i frisk PBX, og prøverne med forkølet 4% paraformaldehyd i PBS i 10-15 minutter ved fire grader Celsius.Efter tre vaske i PBS mærkes kernerne med 0,4 mikrogram pr. milliliter DAPI og forkølet 0,5 % Triton-X i PBS i 15 minutter på is efterfulgt af tre afsluttende vaske i PBS. Monter rutsjebaner med fluorescerende perler, som eksperimentelt relevante og i passende monteringsmedium. Efter fjernelse overskydende montering medium med sterile klude, forsegle en dækslæd til hvert dias med flere lag af klar neglelak, og bruge en fluorescerende mikroskop for at bekræfte en vellykket udførelse af forsøget.Billeder kan derefter tages på et konfokal mikroskop til at indsamle billeder af prøverne inden for en time til en uge efter montering, ved en 630 gange forstørrelse. Disse repræsentative FISH og immunfluorescens resultater er semiquantitative og giver indsigt i oligonucleotid lokalisering, snarere end i sammenligninger mellem intensiteten af de forskellige fluorescerende pletter, fordi disse eksperimenter ikke omfattede en fluorescerende perle i dias præparatet. I disse forsøg var de cytoplasmatiske og nukleare områder og deres forhold forskellige for latente og lytiske KSHV-inficerede celler.Som illustreret i dette tal kontrolleres området i det nukleokytoplasmatiske forhold. Når KSHV DNA replikation er hæmmet i den lytiske fase, den tidlige lytiske protein af KSHV oligonucleotid udskrift skifter til en overvejende cytoplasmatisk lokalisering. KSHV polyadenyleret RNA, dog lokaliserer til specifikke nukleare anlæg på trods af hæmning af viral DNA replikation.Når du fjerner kamrene fra objektglassene, skal du passe på, at der er meget lidt klæberester på værktøjet, og brug ethanol til at permeablisere cellerne og svække limen. Biokemiske analyser såsom QPCR, Western blot, og high-throughput sekventering, kan udføres i tandem for at øge de kvantitative data indsamlet fra mikrografer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flowcytometri-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode til bakteriel små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer af myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiseringer (FISH) til lokalisering af vira og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insektliv Væv

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer farvning og kvantitativ analyse til at bestemme placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler i væv

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering af Candida albicans i murine mave-tarmkanalen ved hjælp fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...