Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

We bedanken Jonathan Roden Fels, Kazimierz Tycowski en Johanna B. Withers voor advies over data-analyse. We danken ook G. Hayward voor het anti-SSB-antilichaam. Dit werk werd gesteund door Grants T32GM007223 en T32AI055403 van de National Institutes of Health (to TKV) en NIH Grant (CA16038) (to JAS). JAS is onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Figuren 1-3 en tabel 1 werden gereproduceerd met toestemming van de American Society for Microbiology onder een Creative Commons Attribution License uit de volgende publicatie: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi Sarcoma-geassocieerde Herpesvirus mRNA accumulatie in nucleaire Foci wordt beïnvloed door virale DNA-replicatie en virale Noncoding Polyadenyleerd nucleair RNA. Journal of virologie. 92 (13), DOI: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).

1. ontwerp van fluorescentie in situ (vis) Anti-sense oligonucleotiden om een specifieke herpesvirale transcriptie te detecteren
<ol><li>Selecteer 25 tot 40 NT segmenten uit de volgorde van RNA van belang en converteren naar zijn anti-Sense. Een succesvolle VISSTRATEGIE kan bestaan uit één tot tien of meer verschillende anti-Sense oligonucleotiden. Houd bij het selecteren van reeksen rekening met het volgende:<ol>
<li>Als het RNA van belang een uniek herhalingsgebied bevat, Profiteer dan van deze functie en ontwerp e...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production.">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).</li><li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

Het protocol dat in dit rapport wordt beschreven, kan worden aangepast aan verschillende celtypen en bevat stappen voor dubbele RNA-vissen en RNA-vissen met als gebruik wordt gemaakt van zowel monoklonaal als polyklonale primaire antilichamen. Hoewel geprepareerde dia's meestal worden afgebeeld met een confocale Microscoop, kan Imaging worden uitgevoerd met een gested (gestimuleerde emissie depletie) Microscoop na wijzigingen van verhoogde antilichaam concentratie en een ander afdekmedium. Voor een betere analyse van afz...

In hun lytische (actieve) fase, herpesvirussen kapen de gastheer cel, waardoor veranderingen in celmorfologie en lokalisatie van biologische moleculen, voor de productie van virionen. De basis van operaties is de Nucleus, waar het dubbel gestrande DNA-virale genoom wordt gerepliceerd en verpakt in een eiwit schil, genaamd een capside1. Om te beginnen, het virus drukt zijn eigen eiwitten, kaping host machines en het voorkomen van expressie van niet-essentiële gastheer genen, een proces genaamd de host uitschakeling effect. De meerderheid van deze activiteit is gelokaliseerd in specifieke 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-vrije nucleaire gebieden genaamd virale replicatie compartimenten, bestaande uit zowel gastheer en virale eiwitten, Rna's, en virale DNA2. De cel wordt gereviseerd om ruimte en middelen te bieden voor de replicatie compartimenten en daarmee het samenstellen van virale capsid's. Zodra de capside de Nucleus verlaat, is het onduidelijk hoe de capside in het cytoplasma is omhuld om een virale deeltje met membraan gebonden te produceren, ook bekend als een virion. Inzicht in de lokalisatie en ruimtelijke verschuivingen van zowel gastheer en virale biomoleules tijdens de lytische fase biedt dieper mechanistisch inzicht in de opstelling van het replicatie compartiment, host-afsluit effect, de virion-egress-route en andere processen in verband met herpes virale infectie en replicatie.
Momenteel is de beste methode om deze veranderingen te detecteren en te bestuderen de visualisatie van eiwitten en Rna's in geïnfecteerde cellen met immunofluorescentie (IF) en fluorescerende in-situ hybridisatie (FISH), respectievelijk. Gebruik van een tijd-cursus met deze technieken onthult de lokalisatie van biomoleules op belangrijke punten van de lytische fase of eenvoudigweg, spatiotemporele gegevens. VIS en als aanvulling op andere biochemische technieken, zoals remming van een cellulair proces (bv. remming van virale DNA-replicatie), RT-qPCR (real-time polymerase kettingreactie), RNA-sequencing, noordelijke blots, massaspectrometrie, Western blotting, en analyse van virale DNA-productie, dat kan een meer globaal beeld van cellulaire activiteiten te bieden.
We ontwikkelden RNA-VISSTRATEGIEËN om de RNA-producten van specifieke genen te onderzoeken en een computationele analyse die de nucleocytoplasmische ratio van een specifiek genproduct kwantitatief berekent. De monstervoorbereiding, aangepast uit eerdere publicaties van Steitz en collega's3,4, is relatief eenvoudig en kan worden gebruikt voor zowel aanhandige als hangende cellen. Het protocol is ook aanpasbaar voor gelijktijdig gebruik van meerdere RNA visstrategieën (dubbel RNA vis) of RNA vis met IF-strategieën. Ontwikkeling van een specifieke VISSTRATEGIE is uitdagend, maar suggesties om succes te verbeteren worden geschetst. De hier beschreven gegevensanalyse is kwantitatief als fluorescerende kralen en sterke markeringen van compartiment grenzen worden gebruikt en biedt aanvullend inzicht in de micro grafieken, inzicht dat observatie bias verwijdert. Het gedetailleerde protocol is ontworpen voor zowel latent en lytische cellen geïnfecteerd door Kaposi Sarcoma-geassocieerde herpesvirus (KSHV) en kan worden gebruikt met niet-geïnfecteerde cellen of cellen geïnfecteerd door andere herpesvirussen5. De methoden van kwantatie zijn van toepassing op studies over nucleocytoplasmische verschuivingen of verplaatsing tussen subcellulaire compartimenten in de meeste cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

Mechanistisch inzicht komt van zorgvuldige studie en kwantificering van specifieke Rna's en eiwitten. De relatieve locaties van deze biomoleculen in de cel op specifieke tijdstippen kunnen worden opgevangen met fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) en immunofluorescentie (if). Tijdens lytische herpesvirus infectie, het virus kaapt de host cel bij voorkeur Express virale genen, waardoor veranderingen in celmorfologie en gedrag van biomoleules. Lytische activiteiten zijn gecentreerd in nucleaire fabrieken, genaamd virale replicatie compartimenten, die alleen met vis kunnen worden onderscheiden en als. Hier beschrijven we een aanpasbaar Protocol van RNA vis en als technieken voor Kaposi van sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)-geïnfecteerde cellen, zowel aanhandig en in suspensie. De methode omvat stappen voor de ontwikkeling van specifieke anti-Sense oligonucleotiden, dubbel RNA vis, RNA vis met IF, en kwantitatieve berekeningen van fluorescentie intensiteiten. Dit protocol is met succes toegepast op meerdere celtypen, niet-geïnfecteerde cellen, latente cellen, lytische cellen, tijd-cursussen, en cellen behandeld met remmers voor het analyseren van de spatiotemporele activiteiten van specifieke Rna's en eiwitten van zowel de menselijke gastheer en KSHV.

De vissen en als de in dit manuscript beschreven methoden worden weergegeven in Figuur 1 , samen met de kwantificering van de resultaten door lijn sporen van de fluorescentie intensiteit. De hier gepresenteerde resultaten zijn semi-kwantitatief en bieden inzicht in lokalisatie, in plaats van vergelijkingen tussen intensiteiten van verschillende fluorescerende vlekken, omdat experimenten geen fluorescerende kraal bevatten in de voorbereiding van de dia. <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We beschrijven een protocol met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) om meerdere herpes virale Rna's binnen lytisch geïnfecteerde menselijke cellen te visualiseren, hetzij in suspensie of aanhanger. Dit protocol omvat de kwantificering van fluorescentie die een nucleocytoplasmische verhouding produceert en kan worden uitgebreid voor gelijktijdige visualisatie van gastheer en virale eiwitten met immunofluorescentie (IF).

Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Het protocol is nuttig voor het verkrijgen van kwantitatief inzicht in de temporele regulatie van virale genproducten, binnen de context van gastheercellen, vooral met betrekking tot herpesvirussen. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van onderzoeksvragen met betrekking tot zowel gastheer als virale RNAs en eiwitten. Bovendien is deze techniek compatibel met gelijktijdige biochemische testen.Om de cellen aan acht kamerdia's te hechten, breng 200 microliter van een inherente celsuspensie aan op elke kamer van een steriele, acht chambered slide en laat zaadgroei gedurende 12-24 uur, bij 37 graden Celsius, en 5% kooldioxide. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatant en niet-verbonden cellen, en onmiddellijk vast te stellen de cellen met voorgekoelde 4%formaldehyde in PBS op ijs, gedurende 30 minuten. Aan het einde van de fixatie, was de cellen met drie, vijf minuten wast in 200 microliters van 4 graden Celsius PBS per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, permeabiliseren van de vaste cellen met 200 microliters van voorgekoelde 0,5%Triton-X in PBS per put, gedurende 10 minuten op ijs. Verwijder aan het einde van de permeabilisatie de kamers voorzichtig zonder de schuif te kraken en spoel de cellen af met voorgekoelde PBS. Blokkeer de gespoelde cellen met voorgekoelde 4%BSA in PBS gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door incubatie met passende polyklonale primaire antilichaam van belang in 0,1%BSA in PBS gedurende een uur, bij vier graden Celsius.Aan het einde van de incubatie was je de cellen drie keer met verse PBS en broed de cellen uit met een passend secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorofokoeïne die compatibel is met het FISH-detecterende antilichaam gedurende een uur, bij vier graden Celsius. Na drie PBS wast zoals aangetoond, bevestig de monsters opnieuw in 4%formaldehyde in PBS gedurende 10-15 minuten voor een seconde permeablisatie zoals aangetoond. Bedek vervolgens de glijbaan met aluminiumfolie om het tl-signaal te behouden en fotobleaching te voorkomen.En was de cellen met 2x zout natriumcitraat, voordat u 45 microliter hybridisatieoplossing toepast. Voeg na een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer gedestilleerd water toe aan de antisense oligonucleotiden van belang om het denaturatievolume op 10 microliter te brengen. Ontature de oligonucleotiden op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, alvorens 35 microliter verse hybridisatieoplossing per dia toe te voegen.Dan incubeer de monsters van 10-24 uur in de bevochtigde kamer op 37 graden Celsius, beschermd met folie. De volgende dag, was de cellen met twee, 10 minuten. 2x zout natriumcitraat wast bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt in 1X zout natriumcitraat gedurende 10 minuten, bij 25 graden Celsius.Na de laatste wasbeurt, bevestig de cellen met voorgekoelde 4%formaldehyde in PBS, gedurende 10-15 minuten op ijs, gevolgd door drie wasbeurten met verse PBS. Vervolgens permeabiliseren van de monsters zoals aangetoond, gevolgd door incubatie met anti-dioxigenine FTC en voorgekoelde 0,1% BSA in PBS, gedurende een uur op vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBX, en bevestig de monsters met voorgekoelde 4%paraformaldehyde in PBS, gedurende 10-15 minuten op vier graden Celsius.Na drie wasbeurten in PBS, label de kernen met 0,4 microgram per milliliter DAPI en voorgekoelde 0,5% Triton-X in PBS gedurende 15 minuten op ijs, gevolgd door drie laatste wasbeurten in PBS. Monteer dia's met fluorescerende kralen, als experimenteel relevant en in passend montagemedium. Na het verwijderen van overtollig montagemedium met steriele doekjes, verzegelen een coverslip naar elke dia met meerdere lagen van duidelijke nagellak, en gebruik een fluorescerende microscoop om een succesvolle uitvoering van het experiment te bevestigen.Beelden kunnen dan worden genomen op een confocale microscoop om beelden van de monsters te verzamelen binnen een uur tot een week na montage, bij een 630 keer vergroting. Deze representatieve FISH en immunofluorescentie resultaten zijn semikwantitieve en bieden inzicht in oligonucleotide lokalisatie, in plaats van in vergelijkingen tussen de intensiteiten van de verschillende fluorescerende vlekken, omdat deze experimenten geen fluorescerende kraal in de dia voorbereiding. In deze experimenten waren de cytoplasmatische en nucleaire gebieden en hun ratio's verschillend voor latente en lytische KSHV geïnfecteerde cellen.Zoals geïllustreerd in deze figuur, wordt het gebied gecontroleerd in de nucleocytoplasmatische verhouding. Wanneer KSHV DNA-replicatie wordt geremd in de lytische fase, verschuift het vroege lytische eiwit van KSHV oligonucleotide transcriptie naar een overwegend cytoplasmatische lokalisatie. KSHV polyadenylated RNA, echter, lokaliseert naar specifieke nucleaire sites, ondanks de remming van virale DNA-replicatie.Bij het verwijderen van de kamers uit de dia's, zorg ervoor dat er zeer weinig lijm residu op het gereedschap, en gebruik ethanol om de cellen permeablize en verzwakken de lijm. Biochemische tests zoals QPCR, Western blot en high-throughput sequencing, kunnen samen worden uitgevoerd om de kwantitatieve gegevens die uit de micrografen worden verzameld, te vergroten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescentie In situ Hybridisatie (LNA flow-FISH): een methode voor Bacteriële Kleine RNA-detectie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisatie<em&gt; In situ</em&gt; Van de speekselklieren, eierstokken, en embryo&#39;s van Vector Muggen

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...