Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
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Wir danken Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski und Johanna B. Withers für die Beratung zur Datenanalyse. Wir danken auch G. Hayward für den Anti-SSB-Antikörper. Diese Arbeit wurde durch die Stipendien T32GM007223 und T32AI055403 von den National Institutes of Health (an TKV) und NIH Grant (CA16038) (an JAS) unterstützt. JAS ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. Die Abbildungen 1-3 und Tabelle 1 wurden mit Genehmigung der American Society for Microbiology unter einer Creative Commons Attribution Lizenz der folgenden Publikation reproduziert: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi es Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Akkumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

1. Entwicklung von Fluoreszenz in situ (FISH) Anti-Sense-Oligonukleotide zum Nachweis einer spezifischen herpesviralen Transkription
<ol><li>Wählen Sie 25 bis 40 nt Segmente aus der Sequenz der RNA von Interesse und konvertieren Sie, um Anti-Sinn zu sein. Eine erfolgreiche FISH-Strategie kann von einem bis zu zehn oder mehr verschiedenen Anti-Sense-Oligonukleotiden enthalten. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Sequenzen Folgendes:<ol>
<li>Wenn die RNA von Interesse einen einzigartigen Wiederholungsbereich enthä...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll kann an verschiedene Zelltypen angepasst werden und enthält Schritte für doppel-RNA-FISH und RNA-FISH mit IF, wobei sowohl monoklonale als auch polyklonale Primärantikörper verwendet werden. Obwohl vorbereitete Dias in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, kann die Bildgebung mit einem STED-Mikroskop (stimulierte Emissionserschöpfung) nach Modifikationen der erhöhten Antikörperkonzentration und einem anderen Montagemedium durchgeführt werden. Zur ...

In ihrer lytischen (aktiven) Phase kapern Herpesviren die Wirtszelle, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und Lokalisierung biologischer Moleküle führt, um Virionen zu erzeugen. Die Operationsbasis ist der Kern, in dem das doppelsträngige DNA-Virusgenom repliziert undin eine Proteinhülle, Capsid 1, verpackt wird. Zu Beginn drückt das Virus seine eigenen Proteine aus, entführt Wirtsmaschinen und verhindert die Expression von nicht-essentiellen Wirtsgenen, ein Prozess, der als Wirtsabschalteffekt bezeichnet wird. Der Großteil dieser Aktivität ist lokalisiert auf spezifische 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)-freie Kernregionen, die als Viralreplikationskompartimenten bezeichnet werden und aus Wirts- und Viralproteinen, RNAs und viraler DNA2bestehen. Die Zelle wird überholt, um Platz und Ressourcen für die Replikationsräume und damit die Montage von viralen Kapsiden bereitzustellen. Sobald das Capsid den Kern verlässt, ist unklar, wie das Capsid in das Zytoplasma eingehüllt wird, um ein membrangebundenes virales Teilchen zu produzieren, das auch als Virion bekannt ist. Das Verständnis der Lokalisierung und räumlichen Verschiebungen von Wirts- und viralen Biomolekülen während der lytischen Phase bietet tiefere mechanistische Einblicke in die Anordnung des Replikationsfachs, den Wirtsabschalteffekt, den Virion-Egress-Pfad und andere Prozesse im Zusammenhang mit herpesviralen Infektionen und Replikationen.
Derzeit ist die beste Methode, um diese Veränderungen zu erkennen und zu untersuchen, die Visualisierung von Proteinen und RNAs in infizierten Zellen mit Immunfluoreszenz (IF) bzw. fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH). Die Verwendung eines Zeitverlaufs mit diesen Techniken zeigt die Lokalisierung von Biomolekülen an zentralen Punkten der lytischen Phase oder einfach, raumzeitliche Daten. FISH und IF ergänzen andere biochemische Techniken, wie z. B. Hemmung eines zellulären Prozesses (z. B. Hemmung der viralen DNA-Replikation), RT-qPCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), RNA-Sequenzierung, Nordflecken, Massenspektrometrie, Western Blotting und Analyse der viralen DNA-Produktion, die ein globaleres Bild der zellulären Aktivitäten liefern kann.
Wir entwickelten RNA-FISH-Strategien, um die RNA-Produkte aus bestimmten Genen zu untersuchen, und eine Rechneranalyse, die das nukleozytoplasmatische Verhältnis eines bestimmten Genprodukts quantitativ berechnet. Die Probenvorbereitung, modifiziert aus früheren Veröffentlichungen von Steitz und Kollegen3,4, ist relativ einfach und kann sowohl für Haftzellen als auch für suspendierte Zellen verwendet werden. Das Protokoll ist auch für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer RNA FISH-Strategien (Double RNA FISH) oder RNA FISH mit IF-Strategien anpassungsfähig. Die Entwicklung einer spezifischen FISH-Strategie ist eine Herausforderung, aber es werden Vorschläge zur Verbesserung des Erfolgs skizziert. Die hier beschriebene Datenanalyse ist quantitativ, wenn fluoreszierende Perlen und starke Marker von Fachgrenzen verwendet werden und bietet zusätzliche Einblicke in die Mikrographen, Erkenntnisse, die Beobachtungsverzerrungen entfernen. Das detaillierte Protokoll ist sowohl für latente als auch für lytische Zellen konzipiert, die mit dem Mit dem Kaposi-Sarkat-assoziierten Herpesvirus (KSHV) infiziert sind, und kann mit nicht infizierten Zellen oder Zellen verwendet werden, die mit anderen Herpesviren infiziert sind5. Die Methoden der Quantifizierung sind auf Studien über nukleozytoplasmatische Verschiebungen oder Relokalisierung zwischen subzellulären Kompartimenten in den meisten Zellen anwendbar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

Mechanistische Erkenntnisse stammen aus einer sorgfältigen Untersuchung und Quantifizierung bestimmter RNAs und Proteine. Die relativen Positionen dieser Biomoleküle in der Zelle zu bestimmten Zeiten können mit Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) erfasst werden. Während einer lytischen Herpesvirus-Infektion entführt das Virus die Wirtszelle, um bevorzugt virale Gene auszudrücken, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Verhalten von Biomolekülen führt. Lytische Aktivitäten konzentrieren sich auf Atomfabriken, die als Viralreplikationsfächer bezeichnet werden und nur mit FISH und IF erkennbar sind. Hier beschreiben wir ein anpassungsfähiges Protokoll von RNA FISH- und IF-Techniken für Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-infizierte Zellen, sowohl anhaftend als auch in Suspension. Die Methode umfasst Schritte zur Entwicklung spezifischer Anti-Sense-Oligonukleotide, Doppel-RNA-FISH, RNA-FISH mit IF und quantitative Berechnungen von Fluoreszenzintensitäten. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf mehrere Zelltypen, nicht infizierte Zellen, latente Zellen, lytische Zellen, Zeitläufe und Zellen angewendet, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um die räumlich-zeitlichen Aktivitäten bestimmter RNAs und Proteine sowohl vom menschlichen Wirt als auch von Proteinen aus dem menschlichen Wirt und KSHV.

Die in diesem Manuskript beschriebenen FISH- und IF-Methoden sind in Abbildung 1 zusammen mit der Quantifizierung der Ergebnisse durch Linienspuren der fluoreszierenden Intensität dargestellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind semiquantitativ und bieten Einblicke in die Lokalisation und nicht in Vergleiche zwischen Intensitäten verschiedener fluoreszierender Flecken, da Experimente keine fluoreszierende Perle in die Diavorbereitung einbeziehen. <strong...

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Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Das Protokoll ist hilfreich, um quantitative Einblicke in die zeitliche Regulation von Virusgenprodukten im Kontext von Wirtszellen, insbesondere in Bezug auf Herpesviren, zu gewinnen. Diese Technik kann helfen, Forschungsfragen im Zusammenhang mit Wirt sanieren und virale RNAs und Proteine zu behandeln. Darüber hinaus ist diese Technik mit gleichzeitigen biochemischen Assays kompatibel.Um die Zellen an acht Kammergleitern zu haften, tragen Sie 200 Mikroliter einer inhärenten Zellsuspension auf jede Kammer eines sterilen, achtkammerigen Dias auf und ermöglichen das Saatgutwachstum für 12-24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie die überstehenden und ungebundenen Zellen, und fixieren Sie sofort die Zellen mit vorgekühlten 4%Formaldehyd in PBS auf Eis, für 30 Minuten. Am Ende der Fixierung die Zellen mit drei, fünf Minuten Wäscht in 200 Mikroliter n4 Grad Celsius PBS pro Wäsche waschen.Nach der letzten Wäsche die festen Zellen mit 200 Mikrolitern vorgekühlten 0,5%Triton-X in PBS pro Brunnen 10 Minuten auf Eis permeabilisieren. Am Ende der Permeabilisation die Kammern vorsichtig entfernen, ohne die Rutsche zu knacken, und spülen Sie die Zellen mit vorgekühltem PBS ab. Blockieren Sie die entspülten Zellen mit vorgekühlten 4%BSA in PBS für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation mit entsprechendem polyklonalen primärer Antikörper von Interesse in 0,1%BSA in PBS für eine Stunde, bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal mit frischem PBS waschen und die Zellen mit einem geeigneten sekundären Antikörper bebrüten, der mit einem fluorophoren konjugierten Fluorophor konjugiert ist, der mit dem FISH-Detektionsantikörper für eine Stunde bei vier Grad Celsius kompatibel ist. Nach drei PBS-Washes, wie gezeigt, fixieren Sie die Proben erneut in 4%Formaldehyd in PBS für 10-15 Minuten vor einer zweiten Permeablisierung, wie gezeigt. Dann bedecken Sie den Schlitten mit Aluminiumfolie, um das fluoreszierende Signal zu erhalten und Photobleichungen zu verhindern.Und waschen Sie die Zellen mit 2x satinasinnatriumcitrat, bevor Sie 45 Mikroliter Hybridisierungslösung auftragen. Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer destilliertes Wasser in die Antisense-Oligonukleotide von Interesse geben, um das Denaturierungsvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen. Denaturieren Sie die Oligonukleotide bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie 35 Mikroliter frischer Hybridisierungslösung pro Rutsche hinzufügen.Dann inkubieren Sie die Proben von 10-24 Stunden in der befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius, mit Folie geschützt. Am nächsten Tag die Zellen mit zwei, 10 Minuten waschen. 2X saline Natriumcitrat wäscht bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Wäsche in 1X satiniertem Natriumcitrat für 10 Minuten, bei 25 Grad Celsius.Nach der letzten Wäsche die Zellen mit vorgekühltem 4%Formaldehyd in PBS für 10-15 Minuten auf Eis fixieren, gefolgt von drei Wäschen mit frischem PBS. Als nächstes permeabilisieren Sie die Proben, wie gezeigt, gefolgt von inkubation mit Anti-Dioxigenin FTC und vorgekühlten 0,1%BSA in PBS, für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischer NEBENstellenanlage waschen und die Proben mit vorgekühltem 4%Paraformaldehyd in PBS fixieren, für 10-15 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach drei Washes in PBS, beschriften Sie die Kerne mit 0,4 Mikrogramm pro Milliliter DAPI und vorgekühlten 0,5%Triton-X in PBS für 15 Minuten auf Eis, gefolgt von drei letzten Wäbungen in PBS. Mount Dias mit fluoreszierenden Perlen, als experimentell relevant und in geeigneter Montagemedium. Nachdem Sie überschüssiges Montagemedium mit sterilen Tüchern entfernt haben, versiegeln Sie einen Deckelrutsch an jedem Schlitten mit mehreren Schichten aus klarem Nagellack und verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die erfolgreiche Durchführung des Experiments zu bestätigen.Die Bilder können dann auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen werden, um Bilder der Proben innerhalb einer Stunde bis zu einer Woche nach der Montage bei einer 630-fachen Vergrößerung zu sammeln. Diese repräsentativen FISH- und Immunfluoreszenzergebnisse sind semiquantitativ und bieten Einblicke in die Oligonukleotid-Lokalisierung und nicht in Vergleiche zwischen den Intensitäten der verschiedenen fluoreszierenden Flecken, da diese Experimente keine fluoreszierende Perle in die Diapräparation einbeziehen. In diesen Experimenten waren die zytoplasmatischen und nuklearen Bereiche und ihre Verhältnisse für latente und lytische KSHV-infizierte Zellen unterschiedlich.Wie in dieser Abbildung dargestellt, wird der Bereich im Nukleozytoplasma-Verhältnis kontrolliert. Wenn die KSHV-DNA-Replikation in der lytischen Phase gehemmt wird, verschiebt sich das frühe lytische Protein der KSHV-Oligonukleotid-Transkription zu einer überwiegend zytoplasmatischen Lokalisation. KSHV polyadenylierte RNA lokalisiert jedoch trotz der Hemmung der viralen DNA-Replikation auf bestimmte Kernstandorte.Achten Sie beim Entfernen der Kammern aus den Dias darauf, dass sich nur sehr geringe Klebstoffrückstände auf dem Werkzeug befinden, und verwenden Sie Ethanol, um die Zellen zu durchdringen und den Klebstoff zu schwächen. Biochemische Tests wie QPCR, Western Blot und High-Throughput-Sequenzierung können gemeinsam durchgeführt werden, um die quantitativen Daten, die aus den Mikrographen gesammelt werden, zu erweitern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...