Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
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조나단 로덴펠스, 카지미에츠 티코스키, 요한나 B. 위더스에게 데이터 분석에 대한 조언을 해주셔서 감사합니다. 우리는 또한 반대로 SSB 항체를 위한 G. Hayward 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (TKV)과 NIH 교부금 (CA16038)에서 T32GM007223 및 T32AI05403 (JAS에)에 의해 지원되었습니다. JAS는 하워드 휴즈 의학 연구소의 조사자입니다. 그림 1-3 및 표 1은 다음 출판물에서 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 미국 미생물학 협회의 허가를 받아 복제되었습니다: Vallery, T. K., 위더스, J. B., 안도, J. A., 스테이츠, J. A. 카포시의 육종 관련 핵 포시에 헤르페스 바이러스 mRNA 축적은 바이러스 DNA 복제 및 바이러스 비코딩 폴리아데닐화 핵 RNA에 의해 영향을 받습니다. 바이러스학의 전표. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

1. 특정 헤르페스 바이러스 전사체를 검출하는 위치 (FISH) 안티 센스 올리고 뉴클레오티드에서 형광의 설계
<ol><li>관심 있는 RNA의 서열로부터 25~40개의 nt 세그먼트를 선택하고 안티센스로 변환한다. 성공적인 FISH 전략은 1개에서 10개 이상의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 시퀀스를 선택할 때 다음을 고려하십시오.<ol>
<li>관심 있는 RNA가 독특한 반복 영역을 포함하는 경우...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production.">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).</li><li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

본 보고서에 기재된 프로토콜은 상이한 세포 유형에 적응될 수 있으며, 단일클론 및 폴리클로날 1차 항체를 모두 사용하는 경우와 함께 이중 RNA FISH 및 RNA FISH에 대한 단계를 포함한다. 준비된 슬라이드는 전형적으로 공초점 현미경으로 이미지화되지만, 증가된 항체 농도 및 상이한 장착 매체의 변형 후 STED(자극방출 고갈) 현미경으로 영상을 수행할 수 있다. 개별 세포의 향상된 분석을 위해, 이 프...

그들의 용리 (활성) 단계에서, 헤르페스 바이러스는 숙주 세포를 납치하여 세포 형태와 생물학적 분자의 국소화의 변화를 일으켜 비리온을 생성합니다. 작전의 기초는 이중 가닥 DNA 바이러스 게놈이 capsid1에게불린 단백질 껍질로 복제되고 포장되는 핵입니다. 시작하기 위하여, 바이러스는 그것의 자신의 단백질을 표현하고, 호스트 기계를 납치하고 비필수 호스트 유전자의 발현을 방지합니다, 프로세스는 호스트 차단 효력을 불릴. 이 활동의 대다수는 특정 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 없는 바이러스 성 복제 구획이라고 불리는, 호스트 및 바이러스 성 단백질,RNA 및 바이러스 DNA 2로 구성된 지역화된다. 셀은 복제 구획에 대한 공간과 자원을 제공하기 위해 정밀 검사되어 바이러스 성 캡시드의 조립을 합니다. 일단 capsid가 핵을 종료하면, 캡시드가 세포질에서 어떻게 비리온이라고도 하는 막 결합된 바이러스성 입자를 생성하기 위하여 포위되는지, 불분명합니다. 용해 단계 도중 호스트와 바이러스성 생체 분자 둘 다의 현지화 그리고 공간 교대의 이해는 복제 구획의 배열, 호스트 차단 효력, virion-egress 통로 및 그밖에 더 깊은 기계론적인 통찰력을 제공합니다 헤르페스 바이러스 감염 및 복제와 관련된 프로세스.
현재 이러한 변화를 감지하고 연구하는 가장 좋은 방법은 각각 동형형형화(FISH)에서 면역형광(IF)과 형광을 가진 감염된 세포에서 단백질과 RNA의 시각화입니다. 이러한 기술을 사용한 타임 코스를 사용하면 용해 단계의 핵심 지점에서 생체 분자의 국소화 또는 단순히 시공간 적 데이터를 알 수 있습니다. FISH 및 IF는 세포 과정의 억제(예를 들어, 바이러스 DNA 복제의 억제), RT-qPCR(실시간 중합효소 연쇄 반응), RNA 시퀀싱, 북부 블롯, 질량 분광법, 웨스턴 블로팅, 및 바이러스 DNA 생산의 분석, 그 세포 활동의 더 글로벌 그림을 제공할 수 있습니다.
우리는 특정 유전자에서 RNA 제품을 검사하는 RNA FISH 전략 및 특정 유전자 생성물의 뉴클레오세포 비율을 정량적으로 계산하는 계산 분석을 개발했습니다. Steitz 및 동료3,4에의해 이전 간행물에서 수정된 샘플 준비는 상대적으로 용이하며 부착 및 부유 셀 모두에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 IF 전략과 다중 RNA FISH 전략 (이중 RNA FISH) 또는 RNA FISH의 동시 사용에 적응할 수 있습니다. 특정 FISH 전략의 개발은 어렵지만 성공을 개선하기 위한 제안이 설명되어 있습니다. 여기에 설명된 데이터 분석은 형광 비드와 구획 경계의 강력한 마커를 사용하고 현미경 조사에 대한 추가 통찰력을 제공하는 경우 정량적이며 관찰 편향을 제거하는 통찰력을 제공합니다. 상세 프로토콜은 Kaposi의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)에 의해 감염된 잠재 세포와 용염 세포를 위해 설계되었으며 다른 헤르페스 바이러스에 감염된 감염되지 않은 세포 또는 세포와 함께 사용할 수있습니다5. 정량의 방법은 대부분의 세포에 있는 subcellular 구획 사이 뉴클레오세포 세포 교대 또는 재국소화에 연구 결과에 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

기계론적 통찰력은 특정 RNA 및 단백질의 신중한 연구 및 정량화에서 옵니다. 특정 시간에 세포 를 통해 이 생체 분자의 상대적인 위치는 위치 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)에 있는 형광으로 붙잡을 수 있습니다. lytic 헤르페스 바이러스 감염 도중, 바이러스는 우대적으로 바이러스성 유전자를 표현하기 위하여 호스트 세포를 납치하고, 생체 분자의 세포 형태 그리고 행동에 있는 변경을 일으키는 원인이 됩니다. Lytic 활동은 원자력 공장을 중심으로, 물고기와 IF로만 식별 할 수있는 바이러스 복제 구획이라고합니다. 여기에서 우리는 카포시의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)에 대한 RNA FISH 및 IF 기술의 적응 프로토콜을 설명합니다, 모두 부착 및 현탁액. 이 방법은 특정 안티 센스 올리고뉴클레오티드, 이중 RNA FISH, IF를 이용한 RNA FISH, 및 형광 강도의 정량적 계산의 개발을 위한 단계를 포함한다. 이 프로토콜은 여러 세포 유형, 감염되지 않은 세포, 잠복 세포, 용리 세포, 시간 과정 및 억제물로 처리된 세포에 성공적으로 적용되어 인간 숙주 및 단백질 모두에서 특정 RNA 및 단백질의 시공간 활동을 분석했습니다. KSHV.

이 원고에 자세히 설명된 FISH 및 IF 방법은 형광 강도의 선 자취에 의한 결과의 정량화와 함께 그림 1에 나와 있습니다. 여기에 제시된 결과는 반정적이며, 실험이 슬라이드 준비에 형광 비드를 포함하지 않았기 때문에 다른 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 지역화에 대한 통찰력을 제공합니다. 도 1은 또한 세포질 및 핵 영?...

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Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

프로토콜은 특히 헤르페스 바이러스와 관련하여 숙주 세포의 맥락에서 바이러스 유전자 제품의 시간적 조절에 대한 정량적 통찰력을 얻는 데 도움이됩니다. 이 기술은 호스트와 바이러스성 RNA 및 단백질 둘 다에 관련있는 연구 질문을 해결하는 것을 도울 수 있습니다. 더욱이, 이 기술은 동시 생화학적 인 분석을 호환합니다.8개의 챔버 슬라이드에 세포를 부착하려면, 멸균의 각 챔버에 내재된 세포 현탁액 200마이크로리터를 적용하고, 8개의 챔버 슬라이드를 바르고, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 12-24시간 동안 종자 성장을 허용한다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 나탄과 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 즉시 얼음에 PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정, 30 분. 고정의 끝에서, 세척 당 섭씨 4도 PBS의 200 마이크로 리터에 3, 5 분 세척으로 세포를 씻어.마지막 세척 후, 고정 된 세포를 200 마이크로 리터의 PBS에서 0.5 % 트리톤-X로 얼음에 10 분 동안 투과화하십시오. 투과화의 끝에서, 조심스럽게 슬라이드를 균열하지 않고 챔버를 제거하고, 미리 차가운 PBS로 세포를 헹구십시오. PBS에서 30분 동안 PBS에서 4%BSA를 미리 냉각한 헹구는 세포를 4도에서 30분 동안 차단한 다음, PBS에서 0.1%BSA에 대한 적절한 다각성 1차 항체를 4°C에서 4도에서 배양한다.인큐베이션이 끝나면 신선한 PBS로 세포를 세 번 세척하고 적절한 이차 항체로 세포를 배양하고 4°C에서 1시간 동안 항체를 검출하는 FISH와 호환되는 플루오라포릭과 결합된 적절한 이차 항체로 세포를 배양한다. 시연된 바와 같이 세 가지 PBS 세차재 후, PBS에서 4%포름알데히드로 샘플을 다시 수정하여 10-15분 동안 두 번째 permeablization 전에 수정합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 형광 신호를 보존하고 광표백을 방지합니다.그리고 혼성화 용액45 마이크로 리터를 적용하기 전에 2 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 세포를 세척하십시오. 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 후, 10 마이크로 리터에 데우음 볼륨을 가지고 관심의 안티 센스 올리고 뉴클레오티드에 증류수를 추가합니다. 슬라이드 당 신선한 혼성화 용액의 35 마이크로 리터를 추가하기 전에 5 분 동안 섭씨 95도에서 올리고 뉴클레오티드를 해독합니다.그런 다음 호일로 보호되는 섭씨 37도에서 가습 챔버에서 10-24 시간에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, 2, 10 분으로 세포를 씻으시면 됩니다. 식염수 나트륨 은 실온에서 세척하고, 섭씨 25도에서 10 분 동안 1 배 식염수 나트륨 구연산나트륨으로 1 회 세척합니다.마지막 세척 후, PBS에서 미리 냉각 된 4 % 포름 알데히드로 세포를 수정하고 얼음에 10-15 분 동안, 신선한 PBS와 세 세척. 다음으로, 입증된 바와 같이 시료를 투약화하고, 이산화방지FTC를 배양하고 PBS에서 0.1%BSA를 사전 냉각하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 구비합니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 PBX에서 슬라이드를 세 번 세척하고 PBS에서 미리 냉각된 4%파라포름알데히드로 샘플을 섭씨 4도에서 10-15분 동안 수정합니다.PBS에서 세 번의 세차재 후, DAPI의 밀리리터 당 0.4 마이크로그램으로 핵을 라벨을 붙이고 PBS에서 0.5%트리톤-X를 얼음으로 15분 간 미리 냉각한 다음 PBS에서 세 번의 최종 세차재가 뒤따릅니다. 형광 구슬이 있는 슬라이드를 실험적으로 관련이 있고 적절한 마운팅 매체로 마운트합니다. 멸균 물티슈로 과도한 장착 매체를 제거한 후, 투명 매니큐어의 여러 코팅으로 각 슬라이드에 하나의 커버슬립을 밀봉하고 형광 현미경을 사용하여 실험의 성공적인 실행을 확인합니다.그런 다음 이미지는 공초점 현미경으로 촬영하여 장착 후 1시간에서 1주일 이내에 630배 배율로 샘플의 이미지를 수집할 수 있습니다. 이러한 대표적인 FISH 및 면역 형광 결과는 반정성이며, 이러한 실험이 슬라이드 제제에 형광 구슬을 포함하지 않았기 때문에 상이한 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 올리고뉴클레오티드 국소화에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 실험에서, 세포질 및 핵 영역 및 그들의 비율은 잠복및 lytic KSHV 감염한 세포를 위해 달랐습니다.이 그림에서 설명한 바와 같이, 영역은 뉴클레오사이클라즘 비에서 조절된다. KSHV DNA 복제가 리틱 단계에서 억제되면 KSHV 올리고뉴클레오티드 전사체의 초기 리틱 단백질이 주로 세포질 국소화로 전환됩니다. KSHV 폴리아데니화 RNA는 바이러스 DNA 복제의 억제에도 불구하고 특정 핵 부위에 국소화된다.슬라이드에서 챔버를 제거 할 때 도구에 접착제 잔류물이 거의 없다는 것을 주의하고 에탄올을 사용하여 세포를 퍼미블화하고 접착제를 약화시십시오. QPCR, 웨스턴 블롯 및 고처리량 시퀀싱과 같은 생화학 적 분석체는 마이크로그래프로부터 수집된 정량적 데이터를 보강하기 위해 나란히 수행될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...