Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
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Agradecemos a Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski e Johanna B. Withers para aconselhamento sobre análise de dados. Agradecemos também ao G. Hayward pelo anticorpo anti-SSB. Este trabalho foi apoiado por subsídios T32GM007223 e T32AI055403 dos institutos nacionais de saúde (TKV) e concessão de NIH (CA16038) (para JAS). JAS é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. As figuras 1-3 e a tabela 1 foram reproduzidas com a permissão da sociedade americana para microbiologia uma licença Creative Commons Attribution da seguinte publicação: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi ' s sarcoma-Associated A acumulação de mRNA do Herpesvirus em focos nucleares é influenciada pela replicação viral do ADN e pelo RNA nuclear Polyadenylated noncoding viral. Jornal de Virology. 92 (13), doi: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).

1. projeto de oligonucleotídeos antisense in situ da fluorescência (peixes) para detectar um transcrito herpética específico
<ol><li>Selecione 25 a 40 segmentos do NT da seqüência do RNA do interesse e converta-o para ser antisense. Uma estratégia bem sucedida dos peixes pode conter de um até dez ou mais oligonucleotides antisense diferentes. Ao selecionar sequências, considere o seguinte:<ol>
<li>Se o RNA do interesse contem uma região original da repetição, a seguir capitalizar nesta característica e pro...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

O protocolo descrito neste relatório pode ser adaptado aos tipos diferentes da pilha e inclui etapas para peixes dobro do RNA e peixes do RNA com o se que usa anticorpos preliminares monoclonais e polyclonal. Embora as corrediças preparadas sejam imaged tipicamente com um microscópio confocal, a imagem latente pode ser executada com um microscópio de STED (depleção de emissão estimulada) após modificações da concentração aumentada do anticorpo e de um meio de montagem diferente. Para análise aprimorada de c?...

Em sua fase lítica (ativa), os herpesvírus sequestram a célula hospedeira, causando alterações na morfologia celular e localização de moléculas biológicas, para produzir virions. A base das operações é o núcleo, onde o genoma viral do DNA duplo-encalhado é replicado e empacotado em um escudo da proteína, chamado um capsídeo1. Para começar, o vírus expressa suas próprias proteínas, seqüestro máquinas hospedeiras e impedindo a expressão de genes de acolhimento não essenciais, um processo denominado o efeito de desligamento do hospedeiro. A maioria desta atividade é localizada a 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-regiões nucleares livres chamadas compartimentos virais da replicação, compreendidos das proteínas do anfitrião e do viral, do RNAs, e do ADN viral2. A célula é revisado para fornecer espaço e recursos para os compartimentos de replicação e, portanto, montagem de capsids virais. Uma vez que o capsídeo sai do núcleo, como o capsídeo é envolvido no citoplasma para produzir uma partícula viral ligada à membrana, também conhecida como um virion, não é clara. A compreensão da localização e dos deslocamentos espaciais de ambos os hospedeiros e biomoléculas virais durante a fase lítica fornece uma introspecção mecanicista mais profunda no arranjo do compartimento da duplicação, do efeito do desligamento do anfitrião, da via do virion-saída, e do outro processos relacionados à infecção herpética e à replicação.
Atualmente, o melhor método para detectar e estudar essas alterações é a visualização de proteínas e RNAs em células infectadas com imunofluorescência (IF) e hibridação in situ fluorescente (FISH), respectivamente. O uso de um curso de tempo com essas técnicas revela a localização de biomoléculas em pontos-chave da fase lítica ou simplesmente, dados espaciotemporais. FISH e IF complementam outras técnicas bioquímicas, como a inibição de um processo celular (por exemplo, inibição da replicação viral do DNA), RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real), sequenciamento de RNA, manchas do Norte, espectrometria de massas, western blotting e análise da produção de DNA viral, que pode fornecer uma imagem mais global das atividades celulares.
Nós desenvolvemos estratégias do RNA Fish para examinar os produtos do RNA dos genes específicos e uma análise computacional que calcule quantitativamente a relação Mimivírus de um produto específico do gene. A preparação da amostra, modificada a partir de publicações anteriores por Steitz e colegas3,4, érelativamente fácil e pode ser usada tanto para as células aderentes como as suspensas. O protocolo também é adaptável para o uso simultâneo de múltiplas estratégias de RNA Fish (duplo RNA FISH) ou RNA FISH com estratégias IF. O desenvolvimento de uma estratégia específica de FISH é desafiador, mas as sugestões para melhorar o sucesso são delineadas. A análise de dados descrita aqui é quantitativa se os grânulos fluorescentes e os marcadores fortes de limites do compartimento são usados e oferecem a introspecção adicional nas micrografias, introspecção que remove o viés da observação. O protocolo detalhado é projetado para as pilhas latentes e Lytic contaminadas por Kaposi ' o Herpesvirus sarcoma-associado de s (KSHV) e pode ser usado com as pilhas ou as pilhas não contaminadas por outros Herpesvirus5. Os métodos de quantificação são aplicáveis a estudos sobre turnos nucleocitímicos ou relocalização entre compartimentos subcelulares na maioria das células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

A introspecção mechanistic chega do estudo cuidadoso e da quantificação de RNAs e de proteínas específicos. As posições relativas destas biomoléculas durante todo a pilha em épocas específicas podem ser capturadas com a hibridação in situ da fluorescência (peixes) e a imunofluorescência (se). Durante a infecção por herpesvírus lítico, o vírus seqüestra a célula hospedeira para expressar preferencialmente genes virais, causando alterações na morfologia celular e no comportamento das biomoléculas. As atividades líticas são centradas em fábricas nucleares, denominadas compartimentos de replicação viral, que são perceptível apenas com FISH e IF. Aqui nós descrevemos um protocolo adaptável de peixes do RNA e se as técnicas para Kaposi ' s sarcoma-associou o Herpesvirus (KSHV)-pilhas infectadas, aderente e na suspensão. O método inclui etapas para o desenvolvimento de oligonucleotides antisense específicos, peixes dobro do RNA, peixes do RNA com se, e cálculos quantitativos de intensidades da fluorescência. Este protocolo foi aplicado com sucesso aos tipos múltiplos da pilha, às pilhas não infectadas, às pilhas latentes, às pilhas Lytic, aos tempo-cursos, e às pilhas tratadas com os nervos inibidores para analisar as atividades armazenamento de RNAs e de proteínas específicas do anfitrião humano e KSHV.

Os métodos FISH e IF detalhados neste manuscrito são mostrados na Figura 1 , juntamente com a quantificação dos resultados por traços de linha de intensidade fluorescente. Os resultados aqui apresentados são semiquantitativos e oferecem insight sobre a localização, em vez de comparações entre intensidades de diferentes manchas fluorescentes, pois experimentos não incluem um cordão fluorescente na preparação da lâmina. A Fig...

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Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

O protocolo é útil para obter uma visão quantitativa sobre a regulação temporal de produtos genéticos virais, no contexto das células hospedeiras, especialmente em relação aos vírus herpes. Esta técnica pode ajudar a abordar questões de pesquisa relacionadas tanto ao hospedeiro quanto às proteínas e proteínas virais. Além disso, essa técnica é compatível com ensaios bioquímicos simultâneos.Para aderir as células a oito lâminas de câmara, aplique 200 microliters de uma suspensão celular inerente a cada câmara de um estéril, oito lâminas de câmara e permitir o crescimento de sementes por 12-24 horas, a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, aspire as células supernaciantes e não-sectadas, e fixar imediatamente as células com formaldeído pré-refrigerado de 4% em PBS no gelo, por 30 minutos. No final da fixação, lave as células com lavagens de três, cinco minutos em 200 microliters de 4 graus Celsius PBS por lavagem.Após a última lavagem, permeabilize as células fixas com 200 microliters de 0,5% Triton-X pré-refrigerado em PBS por poço, por 10 minutos no gelo. No final da permeabilização, remova cuidadosamente as câmaras sem quebrar o slide e enxágue as células com PBS pré-refrigerado. Bloqueie as células enxaguadas com 4%BSA pré-refrigerado em PBS por 30 minutos a quatro graus Celsius, seguido de incubação com anticorpo primário policlonal apropriado de interesse em 0,1%BSA em PBS por uma hora, a quatro graus Celsius.No final da incubação, lave as células três vezes com PBS fresco e incuba as células com um anticorpo secundário apropriado conjugado com um fluorofórico compatível com o anticorpo de detecção de PEIXEs por uma hora, a quatro graus Celsius. Após três lavagens de PBS como demonstrado, fixe as amostras novamente em 4% de formaldeído em PBS por 10-15 minutos antes de uma segunda permeablização como demonstrado. Em seguida, cubra o slide com papel alumínio para preservar o sinal fluorescente e evitar fotobleaching.E lave as células com citrato de sódio salino 2x, antes de aplicar 45 microliters de solução de hibridização. Depois de uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada, adicione água destilada aos oligonucleotídeos antissamo-americanos de interesse para levar o volume de desinaturação a 10 microlitadores. Desnaturar os oligonucleotídeos a 95 graus Celsius por cinco minutos, antes de adicionar 35 microliters de solução de hibridização fresca por slide.Em seguida, incubar as amostras de 10-24 horas na câmara umidificada a 37 graus Celsius, protegidas com papel alumínio. No dia seguinte, lave as células com dois, 10 minutos. 2X lavagem de citrato de sódio salino a temperatura ambiente, seguido de uma lavagem em 1X de citrato de sódio salino por 10 minutos, a 25 graus Celsius.Após a última lavagem, fixar as células com pré-refrigerado 4% de formaldeído em PBS, por 10-15 minutos no gelo, seguido por três lavagens com PBS fresco. Em seguida, permeabilize as amostras como demonstrado, seguido de incubação com anti-dioxigenina FTC e pré-refrigerado 0,1%BSA na PBS, por uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave os slides três vezes em PBX fresco, e fixe as amostras com paraformaldeído pré-refrigerado de 4% em PBS, por 10-15 minutos a quatro graus Celsius.Após três lavagens na PBS, rotule os núcleos com 0,4 microgramas por mililitro de DAPI e pré-refrigerados 0,5% Triton-X em PBS por 15 minutos no gelo, seguido por três lavagens finais em PBS. Monte lâminas com contas fluorescentes, como experimentalmente relevantes e em meio de montagem apropriado. Depois de remover o meio de montagem em excesso com lenços estéreis, sele uma mancha de tampa em cada slide com várias camadas de esmalte transparente e use um microscópio fluorescente para confirmar a execução bem sucedida do experimento.As imagens podem então ser tiradas em um microscópio confocal para coletar imagens das amostras dentro de uma hora a uma semana de montagem, a uma ampliação de 630 vezes. Esses resultados representativos de PEIXEs e imunofluorescência são semiquantitativos e oferecem uma visão sobre a localização do oligonucleotídeo, em vez de comparações entre as intensidades das diferentes manchas fluorescentes, porque esses experimentos não incluíram uma conta fluorescente na preparação do slide. Nesses experimentos, as áreas citoplasmáticas e nucleares e suas proporções foram diferentes para células infectadas latentes e líticas de KSHV.Conforme ilustrado nesta figura, a área é controlada na razão nucleocintísmica. Quando a replicação do DNA de KSHV é inibida na fase lítica, a proteína lítica inicial da transcrição de oligonucleotídeos KSHV muda para uma localização predominantemente citoplasmática. KSHV poliadenylated RNA, no entanto, localiza-se para locais nucleares específicos, apesar da inibição da replicação do DNA viral.Ao remover as câmaras dos slides, tome cuidado para que haja muito pouco resíduo adesivo na ferramenta, e use etanol para permeablar as células e enfraquecer o adesivo. Ensaios bioquímicos como QPCR, mancha ocidental e sequenciamento de alto rendimento, podem ser realizados em conjunto para aumentar os dados quantitativos coletados dos micrografos.

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Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Hibridizações in situ de fluorescêncica (FISH) para localização de vírus e bactérias endossimbióticas em tecidos de plantas e insetos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...