Name: quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Biz veri analizi konusunda tavsiye için Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski ve Johanna B. Withers teşekkür ederiz. Ayrıca G. Hayward'a anti-SSB antikorları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (TKV'ye) ve NIH hibe (CA16038) (JAS'e) T32GM007223 ve T32AI055403 hibeleri ile desteklenmiştir. JAS, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün bir araştırmacısı. Şekil 1-3 ve Tablo 1 Aşağıdaki yayından Creative Commons Atıf lisansı altında Amerikan Mikrobiyoloji Derneği izni ile çoğaltıldı: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Nükleer Foci Herpesvirus mRNA Birikimi Viral DNA Replikasyonu ve Viral Noncoding Polyadenylated Nükleer RNA etkilenir. Viroloji Dergisi. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

1. Belirli bir herpesviral transkript tespit etmek için yerinde floresan tasarımı (FISH) anti-sense oligonükleotidler
<ol><li>İlgi çekici RNA dizisinden 25 ila 40 nt segmentleri seçin ve anti-sense'e dönüştürün. Başarılı bir FISH stratejisi bir kadar on veya daha fazla farklı anti-sense oligonükleotid içerebilir. Dizileri seçerken aşağıdakileri göz önünde bulundurun:<ol>
<li>İlgi alanı benzersiz bir yineleme bölgesi içeriyorsa, bu özellikten yararlanın ve yineleme dizisini hedeflemek içi...

<ol>
	<li>Amen, M. A., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+Non-Coding+RNAs+into+Herpesvirus+Virions:+Comparisons+to+Coding+RNAs.">Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs.</a> Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microRNA+transcript+retention+at+sites+of+transcription+leads+to+enhanced+microRNA+production.">Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production.</a> Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).</li><li>Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+a+triple-helix-forming+RNA+stability+element+in+noncoding+and+genomic+RNAs+of+diverse+viruses.">Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses.</a> Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).</li><li>Weinberg, R. A., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+monodisperse+nuclear+RNA.">Small molecular weight monodisperse nuclear RNA.</a> Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).</li><li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin:+maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction.">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-derived+cell+line+SLK+is+not+of+endothelial+origin,+but+is+a+contaminant+from+a+known+renal+carcinoma+cell+line.">Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line.</a> International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).</li><li>Chiou, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+(ORF74)+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+changes+in+Kaposi's+sarcoma-associated+virus+gene+expression+patterns+following+expression+of+a+tetracycline-inducible+Rta+transactivator.">Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator.</a> Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).</li><li>Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+ORF56,+ORF57,+ORF58,+and+ORF59.">Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59.</a> Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).</li><li>Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyadenylylated+nuclear+RNA+encoded+by+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus.">Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).</li><li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li><li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry.">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li><li>Bruce, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+KSHV+Transcriptome+Following+Primary+Infection+of+Blood+and+Lymphatic+Endothelial+Cells.">Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells.</a> Pathogens. 6 (1), (2017).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li></ol>

Bu raporda açıklanan protokol farklı hücre tiplerine uyarlanabilir ve çift RNA FISH ve RNA FISH için hem monoklonal hem de poliklonal primer antikorlar kullanılarak adımlarını içerir. Hazırlanan slaytlar genellikle konfokal mikroskop ile görüntülense de, artmış antikor konsantrasyonu ve farklı montaj ortamı modifikasyonları yapıldıktan sonra sted (uyarılmış emisyon tükenmesi) mikroskopile görüntüleme yapılabilir. Bireysel hücrelerin gelişmiş analizi için, bu protokol ile hazırlanan örn...

Litik (aktif) fazlarında, herpesvirüsler konak hücreyi kaçırArak hücre morfolojisinde ve biyolojik moleküllerin lokalizasyonunda değişikliklere yol açarak virions üretirler. Operasyonların temeli çekirdektir, burada çift iplikli DNA viral genomu çoğaltılır ve bir protein kabuğuna paketlenir, capsid1olarak adlandırılır. Başlamak için, virüs kendi proteinlerini ifade eder, konak makine kaçırma ve gerekli olmayan konak genlerin ifade sini önleme, bir süreç konak kapatma etkisi olarak adlandırDı. Bu aktivitenin çoğunluğu belirli lokalize 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI)-ücretsiz nükleer bölgeler viral çoğaltma bölmeleri olarak adlandırılan, hem konak ve viral proteinler oluşan, RNA, ve viral DNA2. Hücre çoğaltma bölmeleri ve böylece viral capsids montajı için yer ve kaynak sağlamak için elden geçirilir. Kapsid çekirdekten çıktıktan sonra, kapsidin sitoplazmada nasıl sarsılmış olduğu, virion olarak da bilinen zara bağlı viral parçacık lar ürettiği belirsizdir. Litik fazda hem konak hem de viral biyomoleküllerin lokalizasyonu ve mekansal kaymalarının anlaşılması, çoğaltma bölmesinin düzenlenmesi, konak kapatma etkisi, virion-çıkış yolu ve diğer herpesviral enfeksiyon ve replikasyon ile ilgili süreçler.
Şu anda bu değişiklikleri tespit etmek ve incelemek için en iyi yöntem, sırasıyla immünfloresansan (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile enfekte hücrelerde protein ve RNA görselleştirme olduğunu. Bu tekniklerle bir zaman-ders kullanımı litik faz ın önemli noktalarında biyomoleküllerin lokalizasyonunu ya da basitçe, spatiotemporal verileri ortaya çıkarır. FISH ve IF, hücresel sürecin inhibisyonu (örn. viral DNA replikasyonunun inhibisyonu), RT-qPCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu), RNA sıralama, Kuzey lekeleri, kütle spektrometresi, Batı lekeleme ve hücresel faaliyetlerin daha küresel bir resim sağlayabilir viral DNA üretiminin analizi.
RNA ürünlerini belirli genlerden incelemek için RNA FISH stratejileri ve belirli bir gen ürününün nükleositoplazmik oranını nicel olarak hesaplayan bir hesaplama analizi geliştirdik. Örnek hazırlama, Steitz ve meslektaşları tarafından önceki yayınlardan modifiye3,4, nispeten kolay ve hem yapışık ve askıda hücreler için kullanılabilir. Protokol aynı zamanda birden fazla RNA FISH stratejilerinin (çift RNA FISH) veya IF stratejileri ile RNA FISH'in eşzamanlı kullanımı için de uyarlanabilir. Belirli bir FISH stratejisinin geliştirilmesi zordur, ancak başarıyı artırmak için öneriler özetlenmiştir. Burada açıklanan veri analizi, floresan boncuklar ve bölme sınırlarının güçlü belirteçleri kullanılıyorsa niceldir ve mikrograflar, gözlem önyargısını ortadan kaldıran içgörü hakkında ek bilgiler sunar. Ayrıntılı protokol Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirus (KSHV) tarafından enfekte hem gizli hem de litik hücreler için tasarlanmıştır ve diğer herpesviruses tarafından enfekte olmayan hücreler veya hücreler ile kullanılabilir5. Sayısallaştırma yöntemleri, çoğu hücredeki hücre altı bölmeler arasında nükleositoplazmik kaymalar veya yeniden lokalizasyon çalışmaları için geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:947px;" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">AlexaFluor594-5-dUTP</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:117px;">C1100</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-DIG FITC&#160;</td>
			<td>Jackson Lab Immunologicals</td>
			<td>200-092-156</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SSB Antibody</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ref. Chiou et al. 2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLASTn</td>
			<td>NIH NCBI</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Sequence Alignment Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIG-Oligonucleotide Tailing Kit</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#03353583910</td>
			<td style="width:277px;">2nd Gen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eight-Chamber Slides</td>
			<td>Nunc Lab Tek II</td>
			<td>#154453</td>
			<td style="width:277px;">Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037</td>
			<td style="width:277px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH Probes</td>
			<td>Stellaris</td>
			<td>SMF-2019-1</td>
			<td style="width:277px;">Compatible with protocol, Quasar 670</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH, Bethesda, MD</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoAnalyzer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:277px;">Free Oligonucleotide Analyzer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-150228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VDF-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terminal Transferase</td>
			<td>Sigma Roche</td>
			<td>#003333574001</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl Ribonucleoside Complexes&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:277px;">DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fluorescence in situ hybridization (fish) and immunofluorescence (if) of specific gene products in kshv-infected cells

Mekanistik içgörü dikkatli çalışma ve belirli RNA ve proteinlerin niceliksel gelir. Bu biyomoleküllerin belirli zamanlarda hücre boyunca göreceli konumları, yerinde hibridizasyon (FISH) ve immünofloresan (IF) floresan ile yakalanabilir. Litik herpesvirüs enfeksiyonu sırasında, virüs tercihen viral genleri ifade etmek için konak hücre kaçırArak hücre morfolojisi ve biyomoleküllerin davranış değişikliklerine neden. Litik faaliyetler nükleer fabrikalarda, viral çoğaltma bölmeleri olarak adlandırılan ve sadece FISH ve IF ile ayırt edilebilen merkezler. Burada Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirus (KSHV) enfekte hücreleri için RNA FISH ve IF teknikleri nin uyarlanabilir bir protokolünü açıklıyoruz, hem yapışık hem de süspansiyon. Yöntem, spesifik anti-duyu oligonükleotidlerin, çift RNA FISH, IF ile RNA FISH ve floresan yoğunluklarının nicel hesaplamalarının geliştirilmesi için gerekli adımları içerir. Bu protokol, birden fazla hücre tipine, enfekte olmayan hücrelere, gizli hücrelere, litik hücrelere, zaman-kurslara ve inhibitörlerle tedavi edilen hücrelere, hem insan konakından hem de insan konakçısından gelen spesifik RNA'ların ve proteinlerin spatiotemporal aktivitelerini analiz etmek için başarıyla uygulanmıştır. KSHV.

Bu el yazmasında ayrıntılı olarak açıklanan FISH ve IF yöntemleri, floresan yoğunluğunun çizgi izleriyle sonuçların ölçülmesi ile birlikte Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada sunulan sonuçlar yarı-nicel ve deneyler slayt hazırlanmasında floresan boncuk içermemelidir çünkü farklı floresan lekelerin yoğunlukları arasındaki karşılaştırmalar yerine, lokalizasyon içine fikir sunuyoruz. Şekil 1 ayrıca...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells at JoVE.com

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Protokol, özellikle herpes virüsleri ile ilgili olarak, konak hücreleri bağlamında, viral gen ürünlerinin zamansal düzenleme içine nicel anlayış kazanmak için yararlıdır. Bu teknik, hem ev sahibi hem de viral RNA'lar ve proteinler ile ilgili araştırma sorularının ele alınmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, bu teknik eşzamanlı biyokimyasal tahliller ile uyumludur.Hücreleri sekiz oda slayta yapıştırmak için, steril, sekiz odalı slaytHer odasına doğal bir hücre süspansiyon 200 mikrolitre uygulamak ve 12-24 saat için tohum büyüme izin, 37 derece santigrat, ve% 5 karbondioksit. Kuluçka sonunda, supernatant ve bekar hücreleri aspire, ve hemen önceden soğutulmuş ile hücreleri düzeltmek 4% formaldehit pbs buz üzerinde, için 30 dakika. Fiksasyon sonunda, yıkama başına 4 derece Santigrat PBS 200 mikrolitre üç, beş dakika yıkar hücreleri yıkayın.Son yıkamadan sonra, buz üzerinde 10 dakika boyunca, iyi başına PBS önceden soğutulmuş% 0.5 Triton-X 200 mikrolitre ile sabit hücreleri geçirin. Permeabilizasyon sonunda, dikkatlice slayt çatlama olmadan odaları çıkarın ve önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri durulayın. PBS'de önceden soğutulmuş 4%BSA ile durulanmış hücreleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca bloke edin, ardından pbs'te %0.1 BSA'da uygun poliklonal primer antikorile bir saat, dört santigrat derecede kuluçkaya yat.Kuluçka sonunda, hücreleri taze PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri, FISH'in bir saat boyunca antikor tespitiyle uyumlu, dört derece santigrat derecede uygun bir ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Gösterildiği gibi üç PBS yıkama dan sonra, ikinci permeablizasyondan önce PBS'de %4 formaldehit ile tekrar 10-15 dakika boyunca numuneleri düzeltin. Daha sonra floresan sinyali korumak ve fotobeyazlama önlemek için alüminyum folyo ile slayt kapağı.Ve melezleştirme çözeltisi 45 mikrolitre uygulamadan önce, 2x tuzlu sodyum sitrat ile hücreleri yıkayın. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derece bir saat sonra, 10 mikrolitre denatürasyon hacmi getirmek için ilgi antisense oligonükleotidler distile su ekleyin. Slayt başına 35 mikrolitre taze hibridizasyon çözeltisi eklemeden önce, oligonükleotidleri 5 dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin.Daha sonra 37 santigrat derece nemlendirilmiş odada 10-24 saat, folyo ile korunan örnekleri kuluçka. Ertesi gün hücreleri 2-10 dakika yıkayın. 2X tuzlu sodyum sitrat oda sıcaklığında yıkar, 1X tuzlu sodyum sitrat bir yıkama takip 10 dakika, 25 santigrat derece.Son yıkamadan sonra, pbs önceden soğutulmuş% 4 formaldehit ile hücreleri düzeltmek, buz üzerinde 10-15 dakika, taze PBS ile üç yıkar takip. Daha sonra, gösterildiği gibi örnekleri permeabilize, anti-dioksigenin FTC ve pbs önceden soğutulmuş% 0.1 BSA ile kuluçka takip, dört santigrat derece bir saat için. Kuluçka sonunda, taze PBX üç kez slaytlar yıkayın ve pbs önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit ile örnekleri düzeltmek, dört santigrat derece 10-15 dakika.PBS'de üç yıkamadan sonra çekirdekleri mililitre başına 0,4 mikrogram ve PBS'de %0,5 önceden soğutulmuş Triton-X ile 15 dakika buzüzerinde etiketleyin ve ardından PBS'de üç son yıkama yıkın. Floresan boncuklar ile Montaj slaytlar, deneysel olarak alakalı ve uygun montaj orta. Steril mendillerle fazla montaj ortamını çıkardıktan sonra, her slayta birden fazla kat açık oje ile bir kapak fişi kapatın ve deneyin başarılı bir şekilde gerçekleştirilini onaylamak için floresan mikroskop kullanın.Görüntüler daha sonra 630 kez büyütme, montaj bir saat ila bir hafta içinde örneklerin görüntüleri toplamak için bir konfokal mikroskop üzerinde alınabilir. Bu temsili FISH ve immünofloresan sonuçları yarı kantitatiftir ve farklı floresan lekelerinin yoğunlukları arasındaki karşılaştırmalar yerine oligonükleotid lokalizasyonu hakkında fikir verir, çünkü bu deneyler slayt hazırlığında floresan boncuk içermemelidir. Bu deneylerde sitoplazmik ve nükleer alanlar ile bunların oranları latent ve litik KSHV enfekte hücreler için farklıydı.Bu şekilde gösterildiği gibi alan nükleositoplazmik oranda kontrol edilir. KSHV DNA replikasyonu litik fazda inhibe edildiğinde, KSHV oligonükleotid transkriptinin erken litik proteini ağırlıklı olarak sitoplazmik lokalizasyona geçer. KSHV poliainkargecikmiş RNA, ancak, viral DNA replikasyonuin inhibisyonu rağmen belirli nükleer sitelere lokalize.Slaytlardan odaları çıkarırken, aletüzerinde çok az yapışkan kalıntı sıyrık olduğuna dikkat edin ve hücreleri permeablize etmek ve yapıştırıcıyı zayıflatmak için etanol kullanın. QPCR, Western blot ve yüksek iş elde li dizileme gibi biyokimyasal denemeler, mikrograflardan toplanan nicel verileri artırmak için birlikte yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...