Name: a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

Arbeid relevant for denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung, og Blood Institute tilskudd HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Finansiering også levert av NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot stipend midler fra Children ' s Healthcare av Atlanta og Emory University pediatric Flow flowcytometri Core. Forfatterne vil gjerne takke Dr. hans Deckmyn for deling av 6B4 antistoff, og Emory Children ' s pediatric Research Center Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.

Alle metoder benytter donor-avledet Human blodplater beskrevet her over var godkjent av det institusjonell anmelde råd av Emory universitet/barn ' Healthcare av Atlanta.
1. blodprøve og blodplate isolasjon
<ol><li>Tegn menneskelig blod fra samtykkende friske voksne donorer via venepunksjon på dagen av eksperimentet i 3,8% Trisodium Citrate. En 4,5 mL tube blod er tilstrekkelig til å gi nok blodplater rik plasma (PRP) for 20-25 tilstander i donorer som har blodplater teller nær 250 x 10<...

<ol>
	<li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-voltage-gated+Ca2++influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons.">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li><li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers.">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Cell+Transduction,+Tuning,+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea.">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin.">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li><li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li><li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis.">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).</li><li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils.">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces.">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584 (2016).</li><li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets.">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li><li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13.">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li><li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+shear+stress.">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li><li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III.">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor.">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863 (2016).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress.">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li><li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site.">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li><li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells.">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li><li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry.">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li><li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage.">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li></ol>

Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir rask og allsidig vurdering av effekten av laminær skjær på blodplater og celleoverflaten reseptorer. Den spesifikke representative resultatene som presenteres her understreker hvordan virkningene av multimeric eller bivalent ligander kan påvirkes av skjær flyt. I tillegg til dette programmet, en enhetlig skjær analysen har brede anvendelser i observere skjær-avhengige effekter. I fravær av en kjent ligand-reseptor par, en enhetlig skjær analysen kan også opp...

Mechanoreceptors er proteiner som reagerer på mekaniske stimuli, som trykk eller mekaniske forstyrrelsene/deformasjon. For noen mechanoreceptors, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplisitt til funksjonen av celletyper som de er uttrykt. Ta for eksempel strekk reseptorene i baroreceptor neurons; disse mechanosensitive ion-kanaler regulerer blodtrykket ved sensing vaskulær "Stretch"1,2. I det indre øret oppdager ion-kanaler på hårceller mekaniske deformasjoner forårsaket av lydbølger3, og hud lav terskel Mechanoreceptors (LTMRs) Letter overføring av taktil informasjon4. I andre tilfeller, mechanoreceptors gi viktig informasjon til cellen for etablering av vedheft eller vekst. Celler kan fornemme stivhet i sitt lokale miljø, og kan stole på kontraktile styrker via utgangen cytoskeleton og integrins å diktere vekst eller spredning5,6.
Når man studerer reseptor-ligand interaksjoner i celle-eller vevs BAS ert modeller, finnes det felles analyser som raskt og nøyaktig kan rapportere virkningene av å endre temperatur, pH, ligand konsentrasjon, tonisitet, membran potensial, og mange andre parametre som kan variere i vivo. Men de samme analysene kan komme til kort når det gjelder å påvise bidrag av mekanisk kraft til reseptor aktivering. Enten cellene er sensing deres mikromiljøet, oppdage lydbølger, eller reagerer på strekk, en ting de nevnte mechanoreceptors har til felles er at de deltar i interaksjoner der ligand, reseptoren, eller begge, er forankret til en Overflaten. Analyser utviklet for å teste effekten av mekaniske krefter på reseptor interaksjoner gjenspeiler ofte dette paradigmet. Materialer og Flow kamre brukes til å studere virkningene av skjær flyt på celler og reseptorer7,8. Disse typer eksperimenter har fordelen av å tillate finjustering av skjær rater via etablerte strømningshastigheter. Andre teknikker ansette fluorescerende molekylære sonder for å oppdage krefter brukt av celler på ligand-rike overflater, gir en nøyaktig avlesning av omfanget og orientering av krefter involvert i samspillet9,10.
I tillegg til mechanosensation som oppstår der en eller begge partnerne er forankret til en overflate, kan skjær stress påvirke proteiner og celler i løsningen. Dette er ofte observert i blodceller/proteiner som er konstant i sirkulasjon, og kan manifestere via aktivering av mechanoreceptors som normalt overflate-forankret11, eller gjennom eksponering av mål sekvenser som ville være okkludert under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker analysen effekten av skjærkraft på partikler i løsningen. Noen i løsningen tilnærminger innføre skjær via virvlingen celler i Fluid suspensjon med varierende hastigheter og varigheter, selv om disse tilnærmingene kan ikke tillate en svært presis bestemmelse av skjær stress generert. Rotasjons viskosimetre måler viskositet ved å påføre en spesifikk skjærkraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode for å bestemme effekten av bestemte laminær skjær priser på celler eller celle fragmenter i løsningen.
En av de mest uttrykte proteiner på blodplate overflaten er glykoprotein (GP) IB-IX-komplekset. GPIb-IX er primær reseptoren for plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Sammen har dette reseptor-ligand paret lenge vært anerkjent som grunnlaget for plate responsen for å skjære stress13. I tilfelle vaskulær skade, VWF binder seg til eksponert kollagen i sub-endothelial matrise14, og dermed rekruttere blodplater til skadestedet via VWF-GPIB-IX interaksjon. VWF engasjement til sitt bindende område i GPIbα-delenhet hvis GPIb-IX under fysiologisk skjærbelastning induserer utfoldelsen av en membran-proksimale mechanosensory domene (MSD) som i sin tur aktiverer GPIb-IX15. I en fersk studie har vi vist at antistoffer mot GPIbα, som de som genereres i mange immun trombocytopeni (ITP) pasienter, er også i stand til å indusere blodplater signalering via MSD utfolder seg under skjær stress11. Men i motsetning til VWF, som letter skjær indusert GPIb-IX-aktivering ved å immobilizing komplekset under normal sirkulasjon, er de bivalent Antistoffene i stand til å krysskobling blodplater via GPIb-IX og utfolde MSD i omløp. På denne måte, en mechanoreceptor hvilke er normalt aktivert av overflate immobilisering under klipping kan aktivert inne løsning. I denne rapporten, vil vi demonstrere hvordan en kapillærviskosimeteret-basert uniform skjær analysen ble utnyttes til å oppdage virkningene av bestemte nivåer av skjær stress på reseptor aktivering i løsningen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:413px;">APC anti-human CD62P (P-Selectin)</td>
			<td style="width:128px;">BioLegend</td>
			<td style="width:135px;">304910</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:413px;">Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td>
			<td style="width:128px;">Brookfield</td>
			<td style="width:135px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)</td>
			<td style="width:128px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:135px;">FL-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pooled Normal Human Plasma</td>
			<td>Precision Biologic</td>
			<td>CCN-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:413px;">Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:413px;">Vacutainer Blood Collection Set, 21G x &#190;&#34; Needle</td>
			<td style="width:128px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">367287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a uniform shear assay for human platelet and cell surface receptors via cone-plate viscometry

Mange biologiske celler/vev kjenne de mekaniske egenskapene til sine lokale miljøer via mechanoreceptors, proteiner som kan reagere på krefter som trykk eller mekanisk forstyrrelser. Mechanoreceptors oppdage sine stimuli og overføre signaler via et stort mangfold av mekanismer. Noen av de vanligste rollene for mechanoreceptors er i neuronal svar, som berøring og smerte, eller hårceller som fungerer i balanse og hørsel. Mechanosensation er også viktig for celletyper som regelmessig utsettes for skjær stress som endothelial celler, hvilken linje blodkar, eller blodceller som opplever skjær i normal sirkulasjon. Viskosimetre er enheter som oppdager viskositet av væsker. Rotasjons viskosimetre kan også brukes til å påføre en kjent skjærkraft på væsker. Evnen til disse instrumentene til å innføre ensartet skjær til væsker har blitt utnyttet til å studere mange biologiske væsker, inkludert blod og plasma. Viskosimetri kan også brukes til å søke skjær til cellene i en løsning, og å teste effekten av skjær på bestemte ligand-reseptor parene. Her bruker vi membran-plate viskosimetri å teste effekten av endogene nivåer av skjær stress på blodplater behandlet med antistoffer mot blodplater mechanosensory reseptoren komplekse GPIb-IX.

Figur 1 skisserer hvordan utløse modell av GPIB-IX aktivering, først introdusert for å forklare skjær avhengig reseptor aktivering når forankret til fartøyet veggen, kan også støtte aktivering av blodplater krysskoblet av en multivalent ligand. Figur 2 viser readouts av humant blodplate behandlet av to antistoffer rettet mot N-Terminal domenet til GPIB-IX (6B4 og 11A8), og ett kontroll antistoff (normal IgG) under skåret og statiske forhold. I <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry at JoVE.com

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

En uniform Shear analysen for humant blodplater og Cell Surface reseptorer via Cone-plate Viskosimetri

Vi beskriver en in-løsning metode for å bruke uniform skjær til blodplater overflaten reseptorer ved hjelp av membran-plate viskosimetri. Denne metoden kan også brukes mer generelt til å bruke skjær til andre celletyper og celle-fragmenter og trenger ikke å målrette et bestemt ligand-reseptor-par.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Denne protokollen tillater oss å svare på en rekke spørsmål om hvordan skjær virker på celler i løsningen og gir betydelig kontroll over skjær varighet og størrelse. I motsetning til andre teknikker, som oppdager effekten av skjær på celler som er immobilisert, tillater denne teknikken oss å bruke skjær på celler i løsning og gir seg til et spekter av nedstrøms signaldeteksjonsmetoder. Etter å ha fått perifert blod fra en samtykkende, sunn voksen donor i et 4,5-milliliter rør på 3,8% trisodium citrate, sentrifuge blodet for å oppnå blodplaterikt plasma, og bruk en pipettespiss kuttet i en 45-graders vinkel for å forsiktig fjerne det resulterende topp, overskyet, gult blodplaterikt plasmalag.Oppnå blodplatetallet via fullstendig blodtelling, og juster blodplatetallet til ca. 2,5 ganger 10 til de femte blodplatene per mikroliter med samlet humant blodplatefattig plasma. Deretter plasserer du suspensjonen ved 22 grader Celsius med mild rotasjon. For ligand behandling, sakte legge antistoffet eller ligand av interesse til blodplater-rik plasma, og bland blodplater forsiktig.Under inkubasjonen, slå på kjegleplaten viscometer, og sett platetemperaturen til 22 grader Celsius. Etter fem til 10 minutter overfører du det behandlede blodplaterike plasmaet til det temperaturkontrollerte kjegleplateviscometeret direkte i midten av platen, og ta vare på at hele prøven er avsekom mellom kjegle og plate ved kontaktpunktet. For å bruke skjær på prøven, beregn skjær i henhold til viscometerhåndboken, og bruk skjær på prøven med riktig hastighet og varighet.På slutten av søknaden løfter du kjeglen omtrent to millimeter av platen, slik at prøven forblir i kontakt med både platen og kjeglen, og bruk en gellastende pipettespiss for å samle fem til 10 mikroliter fra midten av prøvevolumet. Inkuber deretter den skjærte prøven med antistoffer mot overflatemarkører av interesse i 20 minutter ved romtemperatur, og fest prøvene i 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur. For å analysere prøvene ved strømningscytometri, samle minst 20.000 hendelser for hver tilstand, og kvantifisere signalstyrken til hver fluorescerende markør, ved hjelp av høydeverdien for intensiteten av hver fluorofor.Bruk deretter en negativ kontroll med storfe serum albumin eller kjøretøy for å tegne en port, unntatt negative bakgrunn fluorescerende hendelser, og kvantifisere prosentandelen av hendelser inne i porten for alle eksperimentelle forhold. Blodplateaktiveringsmarkøruttrykk som svar på skjærkraftapplikasjon er uregulert på en tidsavhengig måte. Her vises representative avlesninger av menneskelig blodplateaktivering i nærvær av to antistoffer rettet mot N-terminaldomenet av glykoprotein 1b-IX og ett kontrollantistoff under skjærede og statiske forhold.Uttrykket for alle tre aktiveringsmarkører ble betydelig økt i nærvær av skjærkrefter og rettet mot antistoffer, sammenlignet med enten statiske forhold eller i nærvær av kontrollantistoffer. Spesielt utløser behandling med antistoff med en uforpliktende kraft for lav til å utløse glykoprotein 1b-IX-aktivering ikke blodplateaktiveringsmarkør upregulation under statiske eller skjærkraftforhold. Videre, plasma fra immun trombocytopeni pasienter som inneholder antistoffer mot glykoprotein 1b-IX utløse skjær avhengige reaksjoner i motsetning til plasma fra pasienter uten glykoprotein 1b-IX rettet mot antistoffer.I tillegg til flowcytometriske analyser kan celler som har vært utsatt for skjær også lyses for vestlig flekk, ELISA og massespesifikasjonsanalyse for å bestemme eventuelle endringer i proteinnivået. Som alltid, når du bruker blod eller menneskelige prøver, sørg for å bruke riktig verneutstyr og følg laboratoriet sikkerhet og blod født patogen retningslinjer for institusjonen din.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomikk

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualisere clathrin endocytose av G-protein-koblede reseptorer på enkelthendelse oppløsning via TIRF Mikros

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode for å velge Struktur-bytte aptamerer Anvendt til en Colorimetric Gold Nanopartikkel analysen

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse av &#39;Skjær Rings&#39;: A Novel endotel modell for Orbital, Enveis og Periodisk Fluid Flow og skjærspenning

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende celle-bildebehandling av blodplategradering og sekresjon under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

En enkel fluorescens-baserte Reporter analysen identifisere cellulære komponenter kreves for Risin gift en kjede (RTA) handel med gjær

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...