Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH-AR047410 (KEM)

يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوان لمركز جامعة ولاية أوكلاهوما للعلوم الصحية IACUC (#2016-03).
1. التهاب الناجم عن كاراجينان (C-II)
<ol><li>تخدير الفئران الذكور و / أو الإناث سبراغ دولي (200-250 غرام؛ 8-9 أسابيع من العمر) مع isoflurane (أو مخدر عن طريق الحقن).</li>
<li>تحقق من عمق التخدير عن طريق ?...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal-epidermal+separation+methods:+research+implications.">Dermal-epidermal separation methods: research implications.</a> Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).</li><li>Baumberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+separation+of+epidermis+from+dermis+and+some+physiologic+and+chemical+properties+of+isolated+epidermis.">Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).</li><li>Felsher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+adherence+of+the+epidermis+to+the+corium.">Studies on the adherence of the epidermis to the corium.</a> Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).</li><li>Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes.">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li><li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+keratinocyte+isolation:+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase.">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li><li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis.">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li><li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation.">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision.">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).</li><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation.">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li><li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair.">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li><li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex.">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li><li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

وقررت الدراسة أن البشرة من جلد مخلب الجرذ الخلفي glabrous تم فصلها بسهولة من الأدمة باستخدام الليسين الحراري (0.5 mG/mL) في PBS مع كلوريد الكالسيوم 1 mM في 4 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. وأشار التقييم النسيجي إلى أن البشرة انفصلت عن الأدمة في غشاء الطابق السفلي وأن التلال الشبكية البشرة سليمة. Thermolysin هو metallo...

تقييم الوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية من الجلد يمكن أن تكون محدودة بسبب عدم التجانس من أنواع الخلايا الموجودة في الأدمة الملتهبة والبشرة1،2،3. وقد استعرضت مؤخرا العديد من الإنزيمات والكيميائية والحرارية ، أو التقنيات الميكانيكية التي تنطوي على فصل طبقتين أو لأداء تفكك الخلايا للتقييم4. حمض, القلويات, الملح محايد, والحرارة يمكن تقسيم البشرة من الأدمة بسرعة, ولكن تورم الخلوية وخارج الخلية غالبا ما يحدث5,6. تريبسين, البنكرياس, الاستاز, keratinase, كولاجيناز, بروناز, ديسباس, وثيرمليسين هي الانزيمات التي استخدمت لفصل البشرة الجلدية4,7. التريبسين والإنزيمات البروتيوليكية واسعة النطاق الأخرى نشطة في 37-40 درجة مئوية ولكن يجب مراقبتها بعناية لمنع تفكك طبقات البشرة. Dispase يشق البشرة في densa lamina، ولكن يتطلب 24 ساعة لفصل في الباردة4،8 أو أقصر timepoints في 37 °C4،9. ومن السمات التي تحد من كل هذه التقنيات هو الاضطراب المحتمل لمورفولوجيا الأنسجة وفقدان سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين.
للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين، ينبغي أن يتم إجراء طريقة فصل الجلد في البرد لفترة قصيرة من الزمن. في تقييم تقنيات فصل الجلد لدراسات الالتهاب ، يعد الهسين الحراري إنزيما فعالا لفصل البشرة عن الأدمة في درجات الحرارة الباردة4. Thermolysin نشطة في 4 درجة مئوية، يشق البشرة hemidesmosomes من لامينا لوسيدا، ويفصل البشرة من الأدمة في غضون 1-3 ح4،8،10. الهدف من هذا التقرير هو تحسين استخدام الثيرمولين لفصل البشرة الفئران الملتهبة من الأدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي ومستويات البروتين للوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية. تم تقديم العديد من التقارير الأولية11،12،13،14،15. الهدف من هذه المخطوطة هو وصف تقنية فصل الجلد الأمثل باستخدام اللدائن الحرارية وإظهار الكشف عن 1) علامات الالتهاب، 2) إنترلوكين-6 (IL-6) مرنا، و 3) عامل نمو الأعصاب (NGF) مرنا والبروتين في البشرة من الفئران مع التهاب الناجم عن الكاراجينان (C-II)16،17. تقرير أولي باستخدام نموذج المساعد فروند الكامل يشير إلى أن NGF مرنا ومستويات البروتين زيادة في وقت مبكر خلال التهاب15. في الفئران، والحساسية الجلد مع التطبيق الموضعي لأوكسيازولون يسبب ارتفاع مبكر في IL-6 مرنا باستخدام التهجين في الموقع36. وقد تورط كل من IL-6 وNGF في C-II18,19, ولكن لم تكن هناك تقارير تصف الحمض النووي الريبي أو مستويات البروتين لIL-6 أو NGF على وجه التحديد من البشرة خلال المراحل الحادة من C-II.
تقنية الهسين الحراري غير مكلفة ومباشرة لأداء. وعلاوة على ذلك، فصل الحرارة من البشرة من الأدمة يسمح لرنا، لطخة الغربية، والتحليل المناعي الكيميائي للوسطاء الالتهابات والعوامل العصبية خلال عملية الالتهاب15. يجب أن يكون المحققون قادرين على استخدام هذه التقنية بسهولة في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية لالتهاب الجلد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

هناك حاجة إلى تقنيات سهلة الاستخدام وغير مكلفة لتحديد إنتاج محدد الموقع من الوسطاء الالتهابية والأعصاب أثناء إصابة الجلد والالتهاب و / أو التوعية. الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول فصل البشرة الجلدية باستخدام الهريسين الحراري ، وهو بروتين ينشط عند 4 درجات مئوية. لتوضيح هذا الإجراء ، يتم تخدير فئران سبراغ دولي ، ويتم حقن الكفوف الخلفية اليمنى بالكاراجينان. بعد ست واثنتي عشرة ساعة من الحقن ، يتم قتل الفئران ذات الالتهاب والجرذان الساذجة ، ويتم وضع قطعة من مخلب هندى ، جلد جلابروس في متوسط النسر المعدل في Dulbecco البارد. ثم يتم فصل البشرة في غشاء الطابق السفلي من الأدمة عن طريق الليسين الحراري في برنامج تلفزيوني مع كلوريد الكالسيوم. بعد ذلك ، يتم تأمين الأدمة عن طريق ملقط التشظي الدقيق ، ويتم مضايق البشرة بلطف. تلطيخ الأزرق Toluidine من أقسام الأنسجة تبين أن البشرة يتم فصلها بشكل نظيف من الأدمة في غشاء الطابق السفلي. جميع طبقات خلايا الكيراتينية لا تزال سليمة، ويلاحظ بوضوح التلال rete البشرة جنبا إلى جنب مع المسافات البادئة من الحليمات الجلدية. يستخدم نوعي وفي الوقت الحقيقي RT-PCR لتحديد عامل نمو الأعصاب ومستويات التعبير interleukin-6. يتم إجراء النشاف الغربي والكيمياء المناعية أخيرا للكشف عن كميات من عامل نمو الأعصاب. يوضح هذا التقرير أن هضم الهضم الحراري البارد هو طريقة فعالة لفصل البشرة عن الأدمة لتقييم الحمض النووي الريبي وتعديلات البروتين أثناء الالتهاب.

تسبب حقن كاراجينان في مخلب الفئران الخلفي الأعراض الكلاسيكية للالتهاب مثل احمرار وذمة16،17. تم قياس تورم مخلب الخلفي مع الفرجار الميكانيكية20. تم الحصول على قيمة خط الأساس لسمك مخلب لكل فأر قبل العلاج كاراجينان وقياسها مرة أخرى في 6 ساعة و 12 ساعة. ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

هنا هو بروتوكول لفصل البشرة من الأدمة لتقييم إنتاج الوسيط الالتهابي. بعد الالتهاب ، يتم فصل البشرة مخلب الجرذ الخلفي من الأدمة عن طريق الدلس الحراري عند 4 درجة مئوية. ثم يتم استخدام البشرة لتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق RT-PCR وتقييم البروتين عن طريق وصمة عار الغربية والكيمياء المناعية.

فصل البشرة الجرذ والأدمة مع Thermolysin للكشف عن موقع محدد الحمض النووي الريبي الالتهابي والبروتين

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

بروتوكولنا هو تقنية فصل البشرة الجلدية سهلة الاستخدام وغير مكلفة لتحديد إنتاج الوسطاء الالتهابيين والأعصاب الخاصة بالموقع أثناء التهاب الجلد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم فصل الأنزيمية من البشرة من الأدمة في أربع درجات مئوية، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على أنواع الوسطاء التي تعمل على توعية المحطات الأولية أثناء الالتهاب الحاد والمزمن لتطوير تدخلات علاجية جديدة.يمكن أن يستفيد التئام الجروح والأمراض الجلدية والجروح المزمنة والحروق من هذا البحث. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الأسطح الظهارية الأخرى، مثل الجهاز الهضمي والقرنيا. قد يختلف وقت الفصل الأمثل قليلا بين المختبرات.يوصى بإجراء تجربة أولية تقارن النقاط الزمنية المختلفة مع تقييم مورفولوجيا 2D لتحديد جودة الفصل. بعد تأكيد عدم وجود استجابة لرد الفعل دواسة في تخدير ثمانية إلى تسعة أسابيع من العمر سبراغ داولي الفئران، حقن تحت الجلد مخلب هند glabrous الحق مع 100 ميكرولتر من 1X لامبدا كاراجينان المخفف في برنامج تلفزيوني. استخدام الفرجار لقياس سمك مشط القدم مخلب الخلفي مباشرة قبل وفي 6 و 12 ساعة بعد الحقن لتحديد حجم وذمة استجابة للتحفيز.عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم مشرط حاد لحصاد قطعة واحدة من ملليمترين من جلد مخلب هند glabrous من مخلب حقن واستخدام ملقط التشحم الدقيق لنقل الجلد إلى ملليلتر واحد من DMEM الباردة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد لمدة 15 إلى 60 دقيقة. في حين أن الأنسجة تحتضن، إضافة ملليلتر واحد من الديناميل الحراري المنشط الطازج إلى 10 آبار من لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا على الجليد. في نهاية الحضانة ، استخدم ملقط التشتت الدقيق لنقل عينة جلد واحدة إلى كل بئر من الهليسين الحراري المنشط ، جانب الطبقة القرنية دون غمر العينات في المحلول.من المهم أن الجلد ليس مغمورة في الزحافية الحرارية، وأن الطبقة القرنية يواجه ما يصل إلى تحقيق فصل فعال. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات، استخدم ملقط التشظي الدقيق لغمر عينة جلد واحدة في سبع إلى ثماني ملليلترات من أربع درجات مئوية DMEM في طبق بيتري للسماح بمساحة أكبر للبشرة للانفصال عن الأدمة. استخدم ملقط لتنظيف البشرة برفق حول محيط الجلد حتى يتم ملاحظة البشرة شبه الشفافة على حدود العينة.عندما ينفصل البشرة بشكل ملحوظ عن الأدمة ، فهم بعناية كل طبقة من الجلد مع زوج واحد من ملقط وسحب البشرة ببطء من الأدمة ، ثم تقييم مدى حساسية البشرة المعزولة عن طريق المجهر الخفيف للتأكد من أنها متسقة بصريا. إذا تم فصل الطبقات بشكل صحيح، ضع الأنسجة الجلدية والجلدية في حاويات فردية من خمس ملليمولار EDTA في DMEM في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تعطيل الهرموسين، قم بإصلاح جزء من البشرة في مثبت مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهياج.في نهاية الحضانة ، ضع الأنسجة الثابتة في 10٪ سكروز في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض ، قبل تجميد العينة في مصفوفة مناسبة لتضمين الأنسجة للقسم. استخدام cryostat للحصول على 14 ميكرومتر سميكة المقاطع العرضية وذوبان جبل المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي المغلفة الجيلاتين. بعد التجفيف على شريحة أكثر دفئا، وصمة عار العينات مع حل العمل من الأزرق toluidine لمدة 90 ثانية.بعد ذلك ، اغسل اللون الأزرق التولويدين برفق من الشرائح مع PBS وعارض الأغطية مع وسيط تصاعد مائي ، ثم لاحظ البشرة مع المجهر برايتفيلد في تكبير 50 إلى 250X. يسبب حقن كاراجينان في مخلب الفئران الخلفي أعراضا كلاسيكية للالتهاب ، مثل الاحمرار والوذمة في كل من 6 و 12 ساعة بعد الحقن. يمكن استخدام المجهر برايتفيلد لتقييم فعالية فصل الزحم الحراري للبشرة والأدمة من جلد مخلب الجرذ الجليدي الخلفي.في الواقع ، يظهر تلطيخ الأزرق التولويدين من المقاطع العرضية البشرة أن البشرة منفصلة عن الأدمة عند الغشاء الأساسي ، ولكن تظل حواف Rete البشرة والمسافات البادئة من الحليمة الجلدية سليمة. علاوة على ذلك ، يتم ملاحظة جميع طبقات خلايا الكيراتينية. النشاف الغربي من البشرة المنفصلة بالحرارة ينتج نتائج متسقة ، مما يشير إلى مستويات بروتين مستقرة خلال هذه التقنية عند أربع درجات مئوية.يتم الكشف عن القليل جدا من البروتين NGF في البشرة الفئران السذاجة، ولكن يتم رفع مستويات البروتين NGF بشكل كبير بعد ست ساعات من الالتهاب الناجم عن الكاراجينان. بعد 12 ساعة من الحقن ، يتم تقليل مستويات NGF مقارنة بتلك التي لوحظت في ست ساعات ، ولكنها تظل مرتفعة بالنسبة للضوابط. كما هو متوقع من تحليل البقع الغربية ، لا يتم الكشف عن النشاط المناعي NGF في عينات أنسجة البشرة للتحكم السذاجة ، ولكن في ست ساعات بعد الالتهاب الناجم عن الكاراجينان ، لوحظ النشاط المناعي ل NGF في معظم خلايا القرنية في غرانوبولوسوم الطبقة والطبقة لوسيدوم.وهناك عدد قليل من الخلايا في سبينوسوم الطبقة هي أيضا NGF المناعي. عند استخدام thermolysin لعزل البشرة سليمة، من المهم أن نتذكر أن وقت الفصل الأمثل يجب أن تحدد تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. يمكن استخدام تقنيات بروتيومية جزيئية مختلفة للتحقق من صحة التعبير عن بروتينات محددة و / أو نصوص الجينات الأولية للتأكد من أن هذا الإجراء لا يغير التعبير القاعدي.ستسمح هذه التقنية للفصل الجلدي الجلدي للباحثين بالإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتعبير الخاص بالموقع عن الأعصاب والوسطاء الالتهابيين في نماذج التهابية جلدية مختلفة. حمض بيريك وبارافورمالديهايد خطرة. العمل مع كل من المواد الكيميائية في غطاء الدخان، واستخدام الملابس الواقية الشخصية والقفازات وغسل وجهك واليدين بعد التعامل معها.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من الأفراد ذوي الأمراض المزمنة التحريضية

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...