Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

Le financement de cette recherche a été fourni par les National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Inflammation induite par le carraghénane (C-II)
<ol><li>Anesthésier les rats Sprague Dawley mâles et/ou femelles (200–250 g; 8–9 semaines) avec de l’isoflurane (ou un anesthésique injectable).</li>
<li>Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en touchant la cornée et en pinçant légèrement la patte postérieure gauche. Lorsque l’animal est co...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. 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B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision.">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).</li><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation.">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li><li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair.">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

L’étude a déterminé que l’épiderme de la peau glabre de la patte postérieure du rat était facilement séparé du derme à l’aide de la thermolysine (0,5 mG / mL) dans le PBS avec 1 mM de chlorure de calcium à 4 ° C pendant 2,5 h. L’évaluation histologique a indiqué que l’épiderme était séparé du derme au niveau de la membrane basale et que les crêtes épidermiques étaient intactes. La thermolysine est une métalloendopeptidase extracellulaire produite parBacillus thermoproteolyticus<sup...

L’évaluation des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques de la peau peut être limitée en raison de l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans le derme et l’épiderme enflammés1,2,3. Plusieurs enzymes, techniques chimiques, thermiques ou mécaniques impliquant la séparation des deux couches ou permettant d’effectuer une dissociation cellulaire pour évaluation ont été revues récemment4. L’acide, l’alcali, le sel neutre et la chaleur peuvent séparer rapidement l’épiderme du derme, mais un gonflement cellulaire et extracellulaire se produit souvent5,6. La trypsine, la pancréatine, l’élastase, la kératinase, la collagénase, la pronase, la dispase et la thermolysine sont des enzymes qui ont été utilisées pour la séparation épidermique-cutanée4,7. La trypsine et d’autres enzymes protéolytiques à grande échelle sont actives à une °C de 37 à 40 °C, mais doivent être surveillées attentivement pour éviter la dissociation des couches épidermiques. Dispase clive l’épiderme à la lamina densa, mais nécessite 24 h pour la séparation dans le froid4,8 ou des points de temps plus courts à 37 ° C4,9. Une caractéristique limitante de toutes ces techniques est la perturbation potentielle de la morphologie des tissus et la perte d’intégrité de l’ARNm et des protéines.
Pour maintenir l’intégrité de l’ARNm et des protéines, une méthode de séparation de la peau doit être effectuée dans le froid pendant une courte période de temps. Dans l’évaluation des techniques de séparation de la peau pour les études sur l’inflammation, la thermolysine est une enzyme efficace pour séparer l’épiderme du derme à des températures froides4. La thermolysine est active à 4 °C, coupe les hémidesmosomes épidermiques de la lamina lucida et sépare l’épiderme du derme en 1–3 h4,8,10. L’objectif de ce rapport est d’optimiser l’utilisation de la thermolysine pour séparer l’épiderme enflammé du rat du derme afin de détecter les niveaux d’ARNm et de protéines pour les médiateurs inflammatoires et les facteurs neurotrophiques. Plusieurs rapports préliminaires ont étéprésentés11,12,13,14,15. L’objectif de ce manuscrit est de décrire une technique optimale de séparation de la peau à l’aide de la thermolysine et de démontrer la détection de 1) marqueurs de l’inflammation, 2) ARNm interleukine-6 (IL-6) et 3) ARNm et protéines du facteur de croissance nerveuse (NGF) dans l’épiderme de rats présentant une inflammation induite par le carraghénane (C-II)16,17. Un rapport préliminaire utilisant le modèle adjuvant complet de Freund indique que les niveaux d’ARNm et de protéines NGF augmentent tôt pendant l’inflammation15. Chez la souris, la sensibilisation cutanée avec l’application topique d’oxazolone provoque une augmentation précoce de l’ARNm IL-6 en utilisant l’hybridation in situ36. L’IL-6 et le NGF ont tous deux été impliqués dans C-II18,19, mais il n’y a eu aucun rapport décrivant les niveaux d’ARNm ou de protéines pour l’IL-6 ou le NGF spécifiquement de l’épiderme pendant les stades aigus de C-II.
La technique de la thermolysine est peu coûteuse et simple à réaliser. De plus, la séparation thermolysine de l’épiderme du derme permet l’ARNm, le transfert de Western et l’analyse immunohistochimique des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques au cours du processus d’inflammation15. Les investigateurs devraient être en mesure d’utiliser facilement cette technique dans les études précliniques et cliniques de l’inflammation de la peau.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
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separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

Des techniques faciles à utiliser et peu coûteuses sont nécessaires pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de lésions cutanées, d’inflammation et / ou de sensibilisation. L’objectif de cette étude est de décrire un protocole de séparation épidermique-cutanée utilisant la thermolysine, une protéinase active à 4 °C. Pour illustrer cette procédure, les rats Sprague Dawley sont anesthésiés et les pattes postérieures droites sont injectées avec du carraghénane. Six et douze heures après l’injection, des rats souffrant d’inflammation et des rats naïfs sont euthanasiés, et un morceau de patte postérieure, la peau glabre est placé dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco froid. L’épiderme est ensuite séparé au niveau de la membrane basale du derme par thermolysine dans le PBS avec du chlorure de calcium. Ensuite, le derme est sécurisé par des pinces à microdissection et l’épiderme est doucement taquiné. La coloration bleu toluidine des coupes de tissu montre que l’épiderme est séparé proprement du derme au niveau de la membrane basale. Toutes les couches de cellules kératinocytes restent intactes et les crêtes épidermiques ainsi que les indentations des papilles dermiques sont clairement observées. La RT-PCR qualitative et en temps réel est utilisée pour déterminer le facteur de croissance nerveuse et les niveaux d’expression de l’interleukine-6. Le western blotting et l’immunohistochimie sont enfin effectués pour détecter des quantités de facteur de croissance nerveuse. Ce rapport illustre que la digestion froide par thermolysine est une méthode efficace pour séparer l’épiderme du derme pour l’évaluation des altérations de l’ARNm et des protéines pendant l’inflammation.

L’injection de carraghénane dans la patte postérieure du rat a provoqué des symptômes classiques d’inflammation tels que rougeur et œdème16,17. Le gonflement de la patte postérieure a été mesuré avec des étriers mécaniques20. Une valeur de référence de l’épaisseur de la patte a été obtenue pour chaque rat avant le traitement au carraghénane et mesurée à nouveau à 6 h et 12 h. L’épaisseur des pattes a été con...

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Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Présenté ici est un protocole pour la séparation de l’épiderme du derme pour évaluer la production de médiateur inflammatoire. Suite à l’inflammation, l’épiderme de la patte postérieure du rat est séparé du derme par la thermolysine à 4 °C. L’épiderme est ensuite utilisé pour l’analyse de l’ARNm par RT-PCR et l’évaluation des protéines par transfert de Western et immunohistochimie.

Séparation de l’épiderme et du derme du rat avec la thermolysine pour détecter l’ARNm et la protéine inflammatoires spécifiques au site

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Notre protocole est une technique de séparation épidermique-cutanée facile à utiliser et peu coûteuse pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de l’inflammation de la peau. Le principal avantage de cette technique est que la séparation enzymatique de l’épiderme du derme est effectuée à quatre degrés Celsius, maintenant l’intégrité de l’ARNm et des protéines. Cette méthode donne un aperçu des types de médiateurs qui sensibilisent les terminaux afférents primaires au cours de l’inflammation aiguë et chronique pour le développement de nouvelles interventions thérapeutiques.La cicatrisation des plaies, les maladies de la peau, les plaies chroniques et les brûlures pourraient bénéficier de cette recherche. Et cette méthode pourrait être appliquée à d’autres surfaces épithéliales, telles que le tractus gastro-intestinal et la cornée. Le temps de séparation optimal peut différer légèrement d’un laboratoire à l’autre.Une expérience préliminaire comparant différents points temporels combinée à une évaluation morphologique 2D est recommandée pour déterminer la qualité de la séparation. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez un rat Sprague Dawley anesthésié âgé de huit à neuf semaines, injecter par voie sous-cutanée la patte postérieure glabre droite avec 100 microlitres de carraghénane 1X Lambda dilué dans du PBS. Utilisez des étriers pour mesurer l’épaisseur du métatarse de la patte postérieure immédiatement avant et 6 et 12 heures après l’injection afin de déterminer le volume de l’œdème en réponse au stimulus.À l’extrémité expérimentale appropriée, utilisez un scalpel pointu pour prélever un morceau de peau glabre de la patte postérieure glabre d’un millimètre sur la patte injectée et utilisez des pinces à microdissection pour transférer la peau dans un millilitre de DMEM froid dans un tube de microcentrifugation sur glace pendant 15 à 60 minutes. Pendant que le tissu est en incubation, ajoutez un millilitre de thermolysine activée fraîchement préparée à 10 puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits sur de la glace. À la fin de l’incubation, utilisez les pinces à microdissection pour transférer un échantillon de peau dans chaque puits de thermolysine activée, côté couche cornée vers le haut sans immerger les échantillons dans la solution.Il est essentiel que la peau ne soit pas immergée dans la thermolysine et que la couche cornée soit orientée vers le haut pour obtenir une séparation efficace. Après deux à trois heures, utilisez la pince à microdissection pour immerger un échantillon de peau dans sept à huit millilitres de quatre degrés Celsius DMEM dans une boîte de Pétri afin de laisser plus d’espace à l’épiderme pour se séparer du derme. Utilisez une pince pour brosser doucement l’épiderme autour du périmètre de la peau jusqu’à ce que l’épiderme presque translucide soit observé aux bords de l’échantillon.Lorsque l’épiderme se sépare sensiblement du derme, saisissez soigneusement chaque couche de peau avec une seule paire de pinces et tirez lentement l’épiderme du derme, puis évaluez la translucidité de l’épiderme isolé par microscopie optique pour vous assurer qu’il est optiquement cohérent. Si les couches ont été correctement séparées, placez les tissus épidermiques et dermiques dans des récipients individuels de cinq millimolaires EDTA dans du DMEM à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la désactivation de la thermolysine, fixez une partie de l’épiderme dans un fixateur approprié pendant une heure à température ambiante avec agitation.À la fin de l’incubation, placer le tissu fixe dans du saccharose à 10% dans du PBS pendant une heure à température ambiante avec agitation, avant de congeler l’échantillon dans une matrice d’incorporation tissulaire appropriée pour le sectionnement. Utilisez un cryostat pour obtenir des sections transversales de 14 micromètres d’épaisseur et les décongeler, montez les sections sur des lames de microscope en verre recouvertes de gélatine. Après séchage sur un chauffe-lames, tacher les échantillons avec une solution de travail de bleu de toluidine pendant 90 secondes.Ensuite, lavez doucement le bleu de toluidine des lames avec du PBS et opposez les couvercles avec un milieu de montage aqueux, puis observez l’épiderme avec la microscopie Brightfield à un grossissement de 50 à 250X. L’injection de carraghénane dans la patte postérieure du rat provoque des symptômes classiques d’inflammation, tels que des rougeurs et un œdème à la fois 6 et 12 heures après l’injection. La microscopie à fond clair peut être utilisée pour évaluer l’efficacité de la séparation thermolysine de l’épiderme et du derme de la peau glabre de la patte postérieure glabre du rat.En effet, la coloration bleu toluidine des coupes transversales épidermiques montre que l’épiderme est séparé du derme au niveau de la membrane de base, mais que les crêtes de Rete épidermiques et les indentations de la papille dermique restent intactes. De plus, toutes les couches de cellules kératinocytes sont observées. Le transfert western de l’épiderme séparé par la thermolysine produit des résultats cohérents, indiquant des niveaux de protéines stables au cours de la technique à quatre degrés Celsius.Très peu de protéine NGF est détectée dans l’épiderme naïf du rat, mais les niveaux de protéine NGF sont significativement régulés à la hausse après six heures d’inflammation induite par le carraghénane. 12 heures après l’injection, les taux de NGF sont réduits par rapport à ceux observés à six heures, mais restent élevés par rapport aux témoins. Comme on peut s’y attendre de l’analyse par transfert western, l’immunoréactivité du NGF n’est pas détectée dans les échantillons de tissu d’épiderme témoin naïf, mais six heures après l’inflammation induite par le carraghénane, l’immunoréactivité du NGF est observée dans la plupart des kératinocytes de la couche granulosum et de la strate lucidum.Quelques cellules de la couche spinosum sont également immunoréactives au NGF. Lors de l’utilisation de la thermolysine pour isoler l’épiderme intact, il est important de se rappeler que le temps de séparation optimal doit être déterminé empiriquement par l’utilisateur final. Diverses techniques protéomiques et moléculaires peuvent être utilisées pour valider l’expression de protéines spécifiques et/ou de transcriptions de gènes primaires afin de confirmer que cette procédure ne modifie pas l’expression basale.Cette technique de séparation épidermique-cutanée permettra aux chercheurs de répondre à des questions supplémentaires concernant l’expression spécifique au site des neurotrophines et des médiateurs inflammatoires dans différents modèles inflammatoires cutanés. L’acide picrique et le paraformaldéhyde sont dangereux. Travaillez avec les deux produits chimiques dans une hotte aspirante, utilisez des vêtements et des gants de protection individuelle et lavez-vous le visage et les mains après la manipulation.

Research

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