Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

מימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH-AR047410 (KEM)

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (#2016-03).
1. דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)
<ol><li>מרדים חולדות ספראג דולי (200-250 גרם; 8-9 שבועות) עם איזופלוראן (או הרדמה להזרקה).</li>
<li>בדוק את עומק ההרדמה על ידי נגיעה בקרנית וצביטה קלה של כף ר...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal-epidermal+separation+methods:+research+implications.">Dermal-epidermal separation methods: research implications.</a> Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).</li><li>Baumberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+separation+of+epidermis+from+dermis+and+some+physiologic+and+chemical+properties+of+isolated+epidermis.">Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).</li><li>Felsher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+adherence+of+the+epidermis+to+the+corium.">Studies on the adherence of the epidermis to the corium.</a> Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).</li><li>Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes.">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li><li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+keratinocyte+isolation:+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase.">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li><li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis.">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li><li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation.">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision.">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).</li><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation.">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li><li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair.">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li><li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex.">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li><li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

המחקר קבע כי האפידרמיס של עור גלברוס כף רגל אחורית חולדה הופרד בקלות דרמיס באמצעות thermolysin (0.5 mG / mL) ב PBS עם 1 mM סידן כלורי ב 4 °C (2.5 שעות). הערכה היסתולוגית הצביעה על כך שהאפידרמיס הופרד מהדרמיס בקרום המרתף וכי רכסי הרט האפידרמליים היו שלמים. תרמוליסין הוא מטאלונדופפטידאאז חוץ-תאי המיוצר על ידי ...

הערכה של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים מהעור יכולה להיות מוגבלת בשל ההטרוגניות של סוגי תאים שנמצאו בדמיס ואפידרמיס מודלקים1,2,3. מספר אנזימים, טכניקות כימיות, תרמיות או מכניות הכוללות הפרדה בין שתי השכבות או לביצוע דיסוציאציה של תאים להערכה נבדקו לאחרונה4. חומצה, אלקלי, מלח ניטרלי, וחום יכול להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס במהירות, אבל נפיחות תאית חוץ תאית מתרחשת לעתים קרובות5,6. טריפסין, לבלב, אלסטאז, קרטינאז, קולגנאז, פרונאז, דיספאז ותרמולצין הם אנזימים ששימשו להפרדה אפידרמלית-עורית4,7. טריפסין ואנזימים פרוטאוליטיים בקנה מידה רחב אחרים פעילים ב 37-40 °C (37 °F), אבל חייב להיות במעקב בקפידה כדי למנוע ניתוק של שכבות אפידרמיס. Dispase מבקע את האפידרמיס בדנסה לאמינה, אבל דורש 24 שעות להפרדה בקור4,8 או נקודות זמן קצרות יותר ב 37 °C4,9. תכונה מגבילה של כל הטכניקות האלה היא ההפרעה הפוטנציאלית של מורפולוגיה של רקמות ואובדן שלמות של mRNA וחלבון.
כדי לשמור על שלמות ה- mRNA והחלבון, יש לבצע שיטת הפרדת עור בקור לפרק זמן קצר. בהערכת טכניקות הפרדת העור למחקרי דלקת, thermolysin הוא אנזים יעיל להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בטמפרטורות קרות4. תרמוליסין פעיל ב 4 °C (55 °F), מבקע את המידזמום האפידרמלי מן למינה לוסידה, ומפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בתוך 1-3 שעות4,8,10. מטרת דו"ח זה היא לייעל את השימוש התרמוליסין להפרדת אפידרמיס חולדה מודלק מדרמיס כדי לזהות רמות mRNA וחלבון עבור מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים. מספר דו"חות ראשוניים הוצגו11,12,13,14,15. מטרת כתב יד זה היא לתאר טכניקה אופטימלית להפרדת העור באמצעות תרמוליסין ולהדגים את הזיהוי של 1) סמנים של דלקת, 2) אינטרלוקין-6 (IL-6) mRNA, ו -3) גורם גדילה עצבי (NGF) mRNA וחלבון באפידרמיס של חולדות עם דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)16,17. דו"ח ראשוני באמצעות מודל אדג'ובנט מלא של פרוינד מציין כי NGF mRNA ורמות חלבון להגדיל מוקדם במהלך דלקת15. בעכברים, רגישות העור עם היישום אקטואלי של oxazolone גורם לעלייה מוקדמת IL-6 mRNA באמצעות הכלאה במקום36. IL-6 ו-NGF היו מעורבים ב-C-II18,19, אך לא היו דיווחים המתארים את רמות ה-MRNA או החלבון עבור IL-6 או NGF במיוחד מהאפידרמיס בשלבים החריפים של C-II.
טכניקת התרמוליסין זולה ופשוטה לביצוע. יתר על כן, הפרדת התרמוליסין של האפידרמיס מדרמיס מאפשרת mRNA, כתם מערבי, וניתוח אימונוהיסטוכימי של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים במהלך תהליך של דלקת15. חוקרים צריכים להיות מסוגלים בקלות להשתמש בטכניקה זו הן במחקרים פרה קליניים והן במחקרים קליניים של דלקת בעור.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

טכניקות קלות לשימוש וזולות נדרשות כדי לקבוע את הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך פגיעה בעור, דלקת ו/או רגישות. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקול הפרדה אפידרמלי-עורי באמצעות תרמוליסין, חלבון הפעיל ב 4 °C (70 °F). כדי להמחיש הליך זה, חולדות ספראג דולי הן מרדים, וכפות אחוריות ימניות מוזרקות לקרגינן. שש ו-12 שעות לאחר ההזרקה, חולדות עם דלקת וחולדות תמימות מורדמות, וחתיכת כף רגל אחורית, עור גלאברוי ממוקם במדיום הנשר המעודכן של דולבקו. האפידרמיס מופרד לאחר מכן בקרום המרתף מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב- PBS עם סידן כלורי. לאחר מכן, הדרמיס מאובטח על ידי מלקחיים זעירים, והאפידרמיס מתגרה בעדינות. כתמים כחולים טולואידין של קטעי רקמות מראים כי האפידרמיס מופרדת בצורה נקייה מן הדרמיס בקרום המרתף. כל שכבות תאי הקרטינוציט נשארות שלמות, ורכסי הרטי האפידרמלי יחד עם חריצים מפפילות עוריות נצפים בבירור. איכותי בזמן אמת RT-PCR משמש כדי לקבוע גורם גדילה עצבי ורמות ביטוי interleukin-6. סופג מערבי ואימונוהיסטוכימיה מבוצעים סוף סוף כדי לזהות כמויות של גורם גדילה עצבי. דו"ח זה ממחיש כי עיכול תרמוליצין קר היא שיטה יעילה להפריד אפידרמיס מדרמיס להערכת mRNA ושינויים בחלבון במהלך דלקת.

הזרקת קרגינן לתוך כף רגלו האחורית של העכברוש גרמה לתסמינים קלאסיים של דלקת כגון אדמומיות ובצקת16,17. הנפיחות של כף רגל האחורית נמדדה עם calipers מכני20. ערך בסיסי של עובי כף רגל הושג עבור כל חולדה לפני טיפול carrageenan ונמדד שוב ב 6 שעות ו 12 שעות. עובי כף רגל?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

מוצג כאן פרוטוקול להפרדת אפידרמיס מדרמיס להערכת ייצור מתווך דלקתי. בעקבות דלקת, אפידרמיס כף רגל אחורית חולדה מופרדת מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב 4 °C (50 °F). האפידרמיס משמש לאחר מכן לניתוח mRNA על ידי RT-PCR והערכה של חלבונים על ידי כתם מערבי ואימונוהיסטוכימיה.

הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

הפרוטוקול שלנו הוא טכניקת הפרדה אפידרמלית-עורית קלה וזולה לקביעת הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך דלקת בעור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הפרדה אנזימטית של האפידרמיס מן הדרמיס מבוצעת בארבע מעלות צלזיוס, שמירה על שלמות mRNA וחלבון. שיטה זו מספקת תובנה על סוגי המתווכים החושניים מסופים אמינים ראשוניים במהלך דלקת חריפה וכרונית להתפתחות התערבויות טיפוליות חדשניות.ריפוי פצעים, מחלות עור, פצעים כרוניים וכוויות יכולים להפיק תועלת ממחקר זה. ושיטה זו יכולה להיות מיושמת על משטחים אפיתל אחרים, כגון מערכת העיכול והקרנית. זמן ההפרדה האופטימלי עשוי להיות שונה במקצת בין המעבדות.ניסוי ראשוני המשווה נקודות זמן שונות בשילוב עם הערכת מורפולוגיה 2D מומלץ לקבוע את איכות ההפרדה. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בחולדת ספראג דולי בת שמונה עד תשעה שבועות, הזריקו באופן תת עורי את כף הרגל האחורית הגלברו הימנית עם 100 מיקרוליטרים של קרגינן 1X למבדה מדולל ב- PBS. השתמש calipers כדי למדוד את עובי metatarsal כף היד האחורית מיד לפני וב 6 ו 12 שעות לאחר ההזרקה כדי לקבוע את נפח בצקת בתגובה לגירוי.בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש באזמל חד כדי לקצור חתיכה אחת על שני מילימטר של עור כף רגל אחורית גלברו מכפפת הכף המוזרקת ולהשתמש במלקחיים microdissection להעביר את העור לתוך מיליליטר אחד של DMEM קר בצינור microcentrifuge על קרח במשך 15 עד 60 דקות. בזמן שהרקמה מדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של תרמוליסין פעיל טרי ל-10 בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות על קרח. בסוף הדגירה, השתמש במלקחיים microdissection כדי להעביר דגימת עור אחת לתוך כל באר של תרמוליסין פעיל, רובד קרנית בצד למעלה מבלי לטבול את הדגימות בתמיסה.זה קריטי כי העור אינו שקוע התרמוליסין וכי קרנית השכבה פונה למעלה כדי להשיג הפרדה יעילה. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, השתמש במלקחיים microdissection כדי לטבול דגימת עור אחת בשבע עד שמונה מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס DMEM בצלחת פטרי כדי לאפשר יותר מקום לאפידרמיס להיפרד הדרמיס. השתמש במלקחיים כדי לצחצח בעדינות את האפידרמיס סביב היקף העור עד האפידרמיס שקוף כמעט נצפה בגבולות המדגם.כאשר האפידרמיס נפרד באופן ניכר מהדרמיס, תפס בזהירות כל שכבה של העור בזוג מלקחיים אחד ומשוך לאט את האפידרמיס מהדרמיס, ואז להעריך את התחלת האפידרמיס המבודדת על ידי מיקרוסקופיה קלה כדי לוודא שהיא עקבית אופטית. אם השכבות הופרדו כראוי, מניחים את הרקמות האפידרמליות והעריות במיכלים בודדים של EDTA חמישה מילימולרים ב- DMEM בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השבתת התרמוליצין, לתקן חלק של האפידרמיס קיבוע מתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה.בסוף הדגירה, מניחים את הרקמה הקבועה ב-10% סוכרוז ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר עם עצבנות, לפני הקפאת הדגימה במטריצה מתאימה להטבעת רקמות לחתך. השתמש cryostat כדי להשיג 14 חתך בעובי מיקרומטר ולהפשיר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין. לאחר הייבוש על מחמם שקופיות, להכתים את הדגימות עם פתרון עובד של טולואידין כחול במשך 90 שניות.לאחר מכן, יש לשטוף בעדינות את טולואידין כחול מהמגלשות עם PBS ולהתנגד לכיסויים עם מדיום הרכבה מימי, ואז להתבונן באפידרמיס עם מיקרוסקופיית ברייטפילד בהגדלה של פי 50 עד 250. הזרקת קרגינן לתוך כף רגלו האחורית של העכברוש גורמת לתסמינים קלאסיים של דלקת, כגון אדמומיות ובצקת הן 6 ו 12 שעות לאחר הזרקה. מיקרוסקופיית ברייטפילד יכולה לשמש להערכת האפקטיביות של הפרדת התרמולצין של האפידרמיס והדרמיס של עור כף רגלו האחורית של החולדה גלברוס.אכן, כתמים כחולים טולואידין של חתך האפידרמיס מראה כי האפידרמיס מופרד מן הדרמיס בקרום הבסיסי, אבל כי רכסי רט האפידרמיס ואת החריצים מן papilla העורי נשארים שלמים. יתר על כן, כל שכבות התא קרטינוציט נצפות. סופג מערבי של האפידרמיס המופרד התרמוליסין מייצר תוצאות עקביות, המצביעות על רמות חלבון יציבות במהלך הטכניקה בארבע מעלות צלזיוס.מעט מאוד חלבון NGF מזוהה באפידרמיס החולדה הנאיבית, אבל רמות חלבון NGF הם רגולציה משמעותית לאחר שש שעות של דלקת הנגרמת על ידי carrageenan. 12 שעות לאחר ההזרקה, רמות NGF מופחתות בהשוואה לאלה שנצפו בשש שעות, אך נשארות גבוהות ביחס לבקרות. כצפוי מניתוח כתם מערבי, חיסוניות NGF אינה מזוהה בדגימות רקמת אפידרמיס בקרה נאיבית, אבל בשש שעות לאחר דלקת הנגרמת carrageenan, NGF חיסוניות נצפתה ברוב הקראטינוציטים של גרנולוזום השכבה ו שבדנית.כמה תאים בספינוסאום השכבה הם גם אימונוריים NGF. בעת שימוש התרמוליסין כדי לבודד את האפידרמיס שלם, חשוב לזכור כי זמן ההפרדה האופטימלי חייב להיקבע אמפירית על ידי משתמש הקצה. ניתן להשתמש בטכניקות פרוטאומיות ומולקולריות שונות כדי לאמת את הביטוי של חלבונים ספציפיים ו/או תמלילי גנים ראשוניים כדי לאשר כי הליך זה אינו משנה את הביטוי הבזלי.טכניקה זו של הפרדה אפידרמלית-עורית תאפשר לחוקרים לענות על שאלות נוספות לגבי הביטוי הספציפי לאתר של נוירוטרופינים ומתווכים דלקתיים במודלים דלקתיים עוריים שונים. חומצה פיארית ופרפורמלדהיד הם מסוכנים. עבוד עם שני הכימיקלים במכסה המנוע של האדים, השתמש בבגדי מגן אישיים וכפפות ושטוף את הפנים והידיים לאחר הטיפול.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...