Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
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この研究のための資金は、国立衛生研究所NIH-AR047410(KEM)によって提供されました

このプロトコルは、オクラホマ州立大学保健科学センターIACUC(#2016-03)の動物ケアガイドラインに従います。
1. カラギーナンによる炎症(C-II)
<ol><li>イゾフルラン(または注射麻酔薬)で男性および/または雌のスプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8〜9週齢)を麻酔する。</li>
<li>角膜に触れ、左後足を軽くつまんで麻酔の深さを確認します。動物が適切に麻酔を受けると、角?...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. 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B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. 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Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li><li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex.">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li><li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

この研究では、ラット後ろ足グラブロス皮膚の表皮は、2.5時間4°Cで1mMの塩化カルシウムを用いたPBSのサーモリシン(0.5 mG/mL)を使用して真皮から容易に分離されると判断した。組織学的評価により、表皮は基膜の真皮から分離され、表皮のレテ尾根はそのままであった。サーモライシンは、グラム陽性(ジオ)サーモプロテオリティクス24によって産生される細胞外...

皮膚からの炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の評価は、炎症を起こした真皮および表皮1、2、3に見られる細胞タイプの不均一性に起因して制限され得る。いくつかの酵素、化学的、熱的、または評価のために細胞解離を行うための2つの層の分離を伴う機械的技術が最近4に見直されている。酸、アルカリ、中性塩、熱は表皮を真皮から素早く分けることができるが、細胞外腫脹は5,6で起こることが多い。トリプシン、膵臓、エラスターゼ、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、およびサーリシンは、表皮皮膚分離4、7に使用されてきた酵素である。トリプシンやその他の広いスケールのタンパク質分解酵素は37~40°Cで活性ですが、表皮層の解離を防ぐために注意深くモニタリングする必要があります。ディスパーゼは、薄層デンサで表皮を切断するが、37°C4、9で冷たい4、8または短いタイムポイントで分離するために24時間を必要とする。これらすべての技術の制限的な特徴は、組織形態の潜在的な破壊およびmRNAおよびタンパク質の完全性の喪失である。
mRNAとタンパク質の完全性を維持するために、皮膚分離方法は、短時間の間、寒さの中で行われるべきである。炎症研究のための皮膚分離技術を評価する際に、サーリシンは、寒い温度4で真皮から表皮を分離するのに有効な酵素である。サーモリシンは、4°Cで活性であり、表皮ヘミデスモソームを層のルシダから切断し、表皮を1-3 h4、8、10以内の真皮から分離する。このレポートの目的は、炎症を起こしたラット表皮を真皮から分離して、炎症性メディエーターおよび神経栄養因子のmRNAおよびタンパク質レベルを検出するためのサーモリシンの使用を最適化することです。いくつかの予備的なレポートが提示されています11,12,13,14,15.本稿の目的は、サーモリシンを用いた最適な皮膚分離技術を記述し、1)炎症の1)マーカーの検出を実証することである、2)インターロイキン-6(IL-6)mRNA、および3)神経成長因子(NGF)mRNAおよびカラギーゲン誘導性炎症を有するラットの表皮中のタンパク質(C-II)16,17。完全なフロイントアジュバントモデルを用いた予備報告は、NGF mRNAおよびタンパク質レベルが炎症の間に早期に増加することを示す15。マウスにおいて、オキサゾロンの局所適用による皮膚感作は、その後ハイブリダイゼーション36に使用するIL-6 mRNAの早期上昇を引き起こす。IL-6とNGFはいずれもC-II18,19に関与しているが、C-IIの急性期の表皮から特異的に表皮からmRNAまたはタンパク質レベルを記述する報告はない。
サーモリシン技術は安価で、実行が簡単です。さらに、真皮からの表皮のサーモリシン分離は、炎症の過程におけるmRNA、ウェスタンブロット、および炎症の過程における炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の免疫組織化学的分析を可能にする15。研究者は、皮膚の炎症の前臨床および臨床研究の両方でこの技術を簡単に使用できるはずです.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

皮膚損傷、炎症、および/または感作中の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するには、使いやすく安価な技術が必要です。本研究の目的は、4°Cで活性であるプロテイナーゼであるサーモリシンを用いた表皮皮膚分離プロトコルを記述することにある。 この手順を説明するために、スプレイグ・ドーリーラットは麻酔を受け、右後足にはカラギーナンを注射する。注射の6時間と12時間後、炎症とナイーブラットを持つラットは安楽死させられ、後足の一部、グラブルーの皮膚は冷たいダルベッコの修正されたイーグル培地に入れられる。表皮は、次いで、塩化カルシウムを用いてPBSでサーリシンによって真皮から基膜で分離される。次に、真皮はマイクロ解剖鉗子によって固定され、表皮は穏やかにからかわれ、組織切片のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜の真皮からきれいに分離されていることを示す。すべてのケラチノサイト細胞層はそのまま残っており、表皮レテの隆起は、真皮乳頭からのくぼみと共に明らかに観察される。定性的およびリアルタイムRT-PCRは、神経成長因子およびインターロイキン-6発現レベルを決定するために使用されます。最終的に、ウエスタンブロッティングと免疫染色法が行われ、神経成長因子の量を検出します。この報告は、炎症時のmRNAおよびタンパク質変化の評価のために、冷熱酵素消化が真皮から表皮を分離する有効な方法であることを示している。

ラット後足へのカラギーナン注射は、赤みや浮腫16、17などの炎症の古典的な症状を引き起こした。後足の腫れをメカニカルキャリパー20で測定した。カラギーナン処理前に各ラットについて足の厚さのベースライン値を得て、6時間および12時間で再び測定した。足の厚さはベースライン値と比較して有意に増加した(<strong class="xfig...

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Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

ここで提示される、表皮を真皮から分離し、炎症性メディター産生を評価するためのプロトコルである。炎症に続いて、ラット後足表皮は、4°Cでサーモリシンによって真皮から分離される。 次に、表皮を、ウエスタンブロットおよび免疫染色法によるRT-PCRおよびタンパク質評価によるmRNA解析に使用する。

ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

我々のプロトコルは、皮膚炎症時の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するための使いやすく、安価な表皮皮膚分離技術である。この技術の主な利点は、真皮からの表皮の酵素分離が摂氏4度で行われ、mRNAとタンパク質の完全性を維持することです。この方法は、新たな治療介入の開発のための急性および慢性炎症の間に原発性の不感性末端を感作するメディエーターの種類に関する洞察を提供する。創傷治癒、皮膚疾患、慢性創傷、および火傷は、この研究の恩恵を受ける可能性があります。そして、この方法は、GI管および角膜のような他の上皮表面に適用することができる。最適な分離時間は、ラボ間で若干異なる場合があります。分離の質を決定するために、異なる時点を2D形態評価と組み合わせた予備的な実験をお勧めします。8~9週齢のスプレイグ・ドーリーラットの麻酔でペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、PBSで希釈した1Xラムダカラギーナンの100マイクロリットルで右グラブロス後足を皮下注射する。カリパーを使用して、注射の直前と6時間と12時間後に後足の中足骨の厚さを測定し、刺激に応答して浮腫の体積を決定します。適切な実験エンドポイントでは、鋭いメスを使用して注入された足からグラブロス後足の皮膚を1ミリメートルずつ収穫し、マイクロディセクション鉗子を使用して氷上のマイクロ遠心チューブ内の冷たいDMEMの1ミリリットルに皮膚を15〜60分間移します。組織がインキュベートしている間に、氷の上の24ウェル細胞培養プレートの10個の井戸に作りたての活性化サーモリシンを1ミリリットル加えます。インキュベーションの最後に、マイクロ解離鉗子を使用して、溶液中にサンプルを浸すことなく、活性化サーモリシン、角層側の各ウェルに1つの皮膚サンプルを移管する。皮膚がサーモリシンに浸からず、角層が直面して効果的な分離を達成することが重要です。2〜3時間後、マイクロ解剖鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルをペトリ皿に7〜8ミリリットルの摂氏DMEMに浸し、表皮が真皮から分離する余地を増やします。鉗子を使用して、サンプルの境界で半透明の表皮が観察されるまで、皮膚の周囲の表皮を優しく磨きます。表皮が真皮から著しく分離する場合、皮膚の各層を1組の鉗子で慎重に把握し、真皮から表皮をゆっくりと引っ張り出し、次に、光顕微鏡で単離された表皮の半透明を評価し、光学的に一貫していることを確認する。層が適切に分離されている場合は、表皮組織と真皮組織をDMEMの5ミリモルEDTAの個々の容器に30分間摂氏4度で配置します。サーモリシンが失活した後、攪拌で室温で1時間、表皮の一部を適切な固定剤で固定する。インキュベーションの終わりに、固定組織をPBSに10%スクロースに入れ、攪拌で室温で1時間、切断に適した組織埋め込みマトリックスでサンプルを凍結する前に行う。クライオスタットを使用して厚さ14マイクロメートルの断面を得て、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライドにセクションを解凍します。スライドウォーマーで乾燥した後、90秒間トルイジンブルーの作業溶液でサンプルを染色します。その後、PBSでスライドからトルイジンブルーを静かに洗浄し、水性取り付け媒体でカバーリップに反対し、50〜250倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡で表皮を観察します。ラット後足へのカラギーナン注射は、注射後6時間と12時間の両方で発赤や浮腫などの炎症の古典的な症状を引き起こす。ブライトフィールド顕微鏡は、ラットグラブロス後足の皮膚の表皮と真皮のサーリシン分離の有効性を評価するために使用することができる。実際、表皮断面のトルイジンブルー染色は、表皮がベースライン膜の真皮から分離されているが、表皮レテ尾根および真皮乳頭からの痕直しがそのまま残っていることを示している。また、ケラチノサイト細胞層の全てが観察される。サーモリシン分離表皮のウェスタンブロッティングは一貫した結果を生じ、4°Cの技術の間に安定したタンパク質レベルを示す。ナイーブラット表皮ではNGFタンパク質が検出されることはほとんどありませんが、6時間のカラギーナン誘発炎症の後、NGFタンパク質レベルは有意にアップレギュレートされます。注射の12時間後、NGFレベルは6時間で観察されたものに比べて低下するが、対照に対して上昇したままである。ウェスタンブロット分析から予想されるように、NGF免疫反応性は、ナイーブコントロール表皮組織サンプルでは検出されないが、カラギーナン誘発炎症後6時間で、NGF免疫反応性は、角層および角層の角質細胞のほとんどで観察される。尖塔内の細胞もNGF免疫反応性である。サーモリシンを使用して無傷の表皮を分離する場合、最適な分離時間はエンドユーザーが経験的に決定しなければならないことを覚えておくことが重要です。様々なプロテオミクスおよび分子技術を用いて、特定のタンパク質および/または一次遺伝子の転写産物の発現を検証し、この手順が基礎的発現を変化させないことを確認することができる。この表皮-真皮分離の技術は、研究者が異なる皮膚炎症性モデルにおける神経トロフィンおよび炎症性メディエーターの部位特異的発現に関する追加の質問に答えることを可能にする。ピク酸とパラホルムアルデヒドは危険です。ヒュームフードの両方の化学物質で作業し、個人的な防護服や手袋を使用し、取り扱い後に顔と手を洗います。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

免疫・感染学

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...