Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

이 연구를 위한 자금조달은 건강 NIH-AR047410 (KEM)의 국가 학회에 의해 제공되었습니다

이 프로토콜은 오클라호마 주립 대학 건강 과학 IACUC (#2016-03)의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 카라게난 유발 염증 (C-II)
<ol><li>남성 및/또는 여성 스프라그 Dawley 쥐 (200-250 g; 8-9 주 이전) 이소플루란 (또는 주 사용 가능한 마취).</li>
<li>각막을 만지고 왼쪽 뒷발을 가볍게 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물이 적절하게 마취되면 각막이나 발 반응이 관찰되지 않습니다.</l...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. 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M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes.">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li><li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+keratinocyte+isolation:+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase.">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li><li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis.">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li><li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation.">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision.">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).</li><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation.">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li><li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair.">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li><li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex.">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li><li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

연구 결과에 따르면, 2.5h에 4°C에서 염화칼슘 1m로 PBS에서 써모리신(0.5 mG/mL)을 사용하여 진피로부터 쥐 뒷발 글래브루스 피부의 표피를 쉽게 분리하였다고 판단했다. 조직학적 평가는 표피가 지하 막의 진피로부터 분리되었고 표피 레테 능선이 손상되지 않았다는 것을 나타냈다. 열량은 그람 양성(Geo)바실러스 열염기 용해성 분석기(24)에의해 생성된 세포 외 금속 loe...

염증성 진피 및 표피1,2,3에서발견되는 세포 유형의 이질성으로 인해 피부로부터의 염증성 중식 및 신경영양인의 평가가 제한될 수 있다. 평가를 위해 세포 해리를 수행하기 위해 2층의 분리 또는 수행을 위한 여러 효소, 화학적, 열 또는 기계적 기술이 최근4개검토되고 있다. 산, 알칼리, 중성염 및 열은 표피를 진피로부터 빠르게 나눌 수 있지만 세포 및 세포 외 부종은 종종5,6에서발생합니다. 트립신, 췌장, 엘라스타제, 각질, 콜라게나아제, 프라나제, 디스파제 및 열량리신은 표피-진피 분리4,7에사용된 효소이다. 트립신 및 기타 광범위한 스케일 의 성기 분석 효소는 37-40 °C에서 활성화되지만 표피 층의 해리를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링해야합니다. 디스파스는 라미나 덴사에서 표피를 갈라놓지만, 감기4,8 또는 37°C4,9에서더 짧은 시간점에서 분리를 위해 24h가 필요하다. 이러한 모든 기술의 제한 적인 특징은 조직 형태학의 잠재적인 중단 및 mRNA와 단백질의 무결성의 손실.
mRNA와 단백질의 무결성을 유지하기 위해, 피부 분리 방법은 짧은 시간 동안 추위에서 수행되어야한다. 염증 연구를 위한 피부 분리 기술을 평가할 때, 써모리신은 추운 온도4에서진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 효소이다. 열리신은 4°C에서 활성화되며, 라미나 루치다로부터 표피 이미데스모좀을 갈라지고, 표피를 1-3h4,8,10내의 진피로부터 분리한다. 이 보고서의 목표는 염증성 중재자 및 신경 영양 요인에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 검출하기 위해 진피에서 염증이 있는 쥐 표피의 분리를 위한 열립혈증의 사용을 최적화하는 것입니다. 여러 예비 보고서는11,12,13,14,15를제시했다. 이 원고의 목적은 열분해신을 이용한 최적의 피부 분리 기법을 설명하고 염증의 1) 마커, 2) 인터류킨-6(IL-6) mRNA, 및 3) 신경 성장 인자(NGF) mRNA 및 단백질을 카라게난 유발 염증(C-II)16,17의표피에서 시연하는 것이다. 완전한 Freund의 보조 모델을 사용하여 예비 보고서는 NGF mRNA및 단백질 수준이 염증15도중 일찌기 증가한다는 것을 나타냅니다. 마우스에서, oxazolone의 국소 적용을 이용한 피부 민감화는 시투혼성화(36)에서사용하는 IL-6 mRNA에서 조기 상승을 일으킨다. IL-6과 NGF 는 모두 C-II18,19에서연루되었지만 C-II의 급성 단계 동안 표피로부터 특히 IL-6 또는 NGF에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 설명하는 보고는 없었습니다.
열리 신 기술은 저렴 하 고 수행 하기 간단. 더욱이, 진피로부터 표피의 열리신 분리는염증(15)의과정에서 염증 중과및 신경영양인의 mRNA, 서부 블롯 및 면역히스트토화학적 분석을 허용한다. 연구원은 쉽게 피부 염증의 전임상 및 임상 연구 모두에서이 기술을 사용할 수 있어야 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

사용이 간편하고 저렴한 기술은 피부 손상, 염증 및/또는 민감화 중에 염증 성 중재자 및 신경 영양증의 사이트 별 생산을 결정하는 데 필요합니다. 이 연구의 목적은 4°C에서 활성단백질인 써모리신을 사용하여 표피-진피 분리 프로토콜을 설명하는 것이다. 이 절차를 설명하기 위해, 스프라그 Dawley 쥐는 마취되고, 오른쪽 뒷발은 카라지난으로 주입됩니다. 주입 후 6 시간 및 12 시간, 염증과 순진한 쥐를 가진 쥐는 안락사되고, 뒷발, 글라브루스 피부는 차가운 덜벡코의 수정 된 독수리 매체에 배치됩니다. 표피는 염화칼슘을 가진 PBS에 있는 열분해에 의해 진피에서 지하 막에서 분리됩니다. 다음으로, 진피는 미세 절 집게에 의해 고정되고 표피가 부드럽게 조롱됩니다. 조직 섹션의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막의 진피에서 깨끗하게 분리되어 있음을 보여줍니다. 모든 각질 세포 층은 그대로 유지되며, 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 리트 능선이 명확하게 관찰됩니다. 질적 및 실시간 RT-PCR은 신경 성장 인자와 인터류키-6 발현 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 서양 블로팅 및 면역 히토화학은 마침내 신경 성장 인자의 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 이 보고는 감기 열분해 소화가 염증 도중 mRNA및 단백질 변경의 평가를 위한 진피에서 표피를 분리하는 효과적인 방법이다는 것을 보여줍니다.

쥐 뒷발에 카라게난 주사는 발적과 부종16,17과같은 염증의 고전적인 증상을 일으켰다. 뒷발의 붓기는 기계식캘리퍼(20)로측정되었다. 발 두께의 기준값은 카라게난 치료 전에 각 쥐에 대해 얻어지고 6h 및 12h에서 다시 측정하였다. 발 두께는 기준값(도1)에비해 크게 증가하였다.
쥐 글래브로스...

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Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

여기에 제시된 표피의 분리를 위한 프로토콜이 진피로부터 염증성 중재자 생산을 평가하기 위한 것이다. 염증에 따라, 쥐 뒷발 표피는 4°C에서 열리신에 의해 진피로부터 분리된다. 표피는 그 때 서쪽 blot 및 면역 작용화학에 의하여 RT-PCR 및 단백질 평가에 의하여 mRNA 분석을 위해 이용됩니다.

부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

우리의 프로토콜은 피부 염증 중 염증 성 중재자와 신경 영양의 사이트 별 생산을 결정하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 표피 - 진피 분리 기술입니다. 이 기술의 주요 장점은 진피로부터 표피의 효소 분리가 4°C에서 수행되어 mRNA 와 단백질의 무결성을 유지한다는 것입니다. 이 방법은 새로운 치료 내정간섭의 발달을 위한 급성 및 만성 염증 도중 1 차적인 발포성 단자 감속하는 중재자의 모형에 통찰력을 제공합니다.상처 치유, 피부 질환, 만성 상처 및 화상은이 연구에서 유익할 수 있습니다. 그리고 이 방법은 기관 및 각막과 같은 다른 상피 표면에 적용될 수 있었다. 최적의 분리 시간은 실험실 간에 약간 다를 수 있습니다.분리의 품질을 결정하기 위해 2D 형태 평가와 결합된 다른 시간 지점을 비교하는 예비 실험이 권장됩니다. 마취 된 8 ~ 9 주 된 스프라그 Dawley 쥐에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, PBS에서 희석 된 1X 람다 카라게난100 마이크로 리터로 오른쪽 글래브로우스 뒷발을 피하로 주입합니다. 캘리퍼를 사용하여 주사 후 6 시간 및 12 시간 후 뒷발 중족골 두께를 측정하여 자극에 대한 응답으로 부종의 부피를 결정합니다.적절한 실험 적 끝점에서, 주입 된 발에서 글래브로스 뒷발 피부의 하나 2 밀리미터 조각을 수확하고 마이크로 디즈 섹션 집게를 사용하여 15 ~ 60 분 동안 얼음에 미세 원심 분리 튜브에서 차가운 DMEM의 1 밀리리터로 피부를 전송합니다. 조직이 배양하는 동안, 얼음에 24 웰 세포 배양 판의 10 우물에 갓 준비 된 활성 열분해신 의 1 밀리리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1개의 피부 샘플을 용액에 침지하지 않고 활성화된 열량, 각막 면의 각 우물으로 옮기는 것입니다.피부가 열립에 침지되지 않고 지층 각막이 효과적인 분리를 달성하기 위해 직면하는 것이 중요합니다. 2~3시간 후, 미세 절개 집게를 사용하여 페트리 접시에 섭씨 4도의 7~8밀리리터에 한 개의 피부 샘플을 담그어 표피가 진피에서 분리할 수 있는 더 많은 공간을 허용합니다. 시료의 경계에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 집게를 사용하여 피부 둘레의 표피를 부드럽게 브러시합니다.표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면, 조심스럽게 한 쌍의 집게로 피부의 각 층을 잡고 천천히 진피에서 표피를 당긴 다음, 광적으로 일관적있는지 확인하기 위해 빛 현미경에 의해 격리 된 표피의 투명도를 평가합니다. 층이 제대로 분리된 경우 표피 및 진피 조직을 DMEM에 있는 5밀리미터 EDTA의 개별 용기에 30분 동안 섭씨 4도에 넣습니다. 열분해 후, 동요와 실온에서 1 시간 동안 적절한 고정에 표피의 일부를 수정합니다.인큐베이션의 끝에서, 교반과 실온에서 1 시간 동안 PBS에 고정 된 조직을 배치, 단면에 적합한 조직 포함 매트릭스에 샘플을 동결하기 전에. 저온을 사용하여 14 마이크로미터 두께의 단면을 얻고 해동하여 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하십시오. 슬라이드 워머에서 건조한 후 90초 동안 toluidine blue의 작동 용액으로 샘플을 얼룩지게 합니다.그 후, PBS로 슬라이드에서 톨루이딘 블루를 부드럽게 씻고 수성 장착 매체로 커버립을 반대한 다음 50~250X 배율로 브라이트필드 현미경으로 표피를 관찰합니다. 쥐 뒷발에 카라게난 주사는 염증의 고전적인 증상을 일으키는, 둘 다에 발적과 부종 등 6 그리고 12 시간 후 주입. 브라이트필드 현미경 검사는 쥐 글래브루스 뒷발 피부의 표피와 진피의 열량 분리의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다.실제로, 표피 단면의 토루이딘 블루 염색은 표피가 기준막의 진피로부터 분리되어 있지만, 표피 레테 능선과 진피 유두로부터의 들여쓰기가 그대로 유지된다는 것을 보여준다. 또한, 모든 각질 세포 층이 관찰된다. 열리 신 분리 표피의 서쪽 얼룩은 4 섭씨에서 기술 도중 안정적인 단백질 수준을 나타내는 일관된 결과를 생성합니다.아주 작은 NGF 단백질은 순진한 쥐 표피에서 검출됩니다, 그러나 NGF 단백질 수준은 카라지난 유도한 염증의 6 시간 후에 현저하게 강화됩니다. 주입 후 12시간 후, NGF 수준은 6시간 동안 관찰된 수준에 비해 감소되지만 컨트롤에 비해 높은 수준을 유지합니다. 서양 블롯 분석에서 예상대로, NGF 면역 반응성은 순진한 대조표 조직 샘플에서 검출되지 않지만, 카라게난 유도 염증 후 6 시간 에서 NGF 면역 반응성은 지층 과립 및 지층 루시덤의 대부분의 각질 세포에서 관찰됩니다.지층 스피노섬에 있는 몇몇 세포는 또한 NGF 면역반응성이다. 열리신을 사용하여 손상되지 않은 표피를 분리하는 경우 최적의 분리 시간이 최종 사용자가 경험적으로 결정해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 다양한 프로테오믹 및 분자 기술은 특정 단백질 및/또는 1차 유전자 전사체의 발현을 검증하여 이 절차가 기저 발현을 변경하지 않는다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다.표피 진피 분리의이 기술은 연구원이 다른 피부 염증 모델에서 신경 trophins 및 선동적인 중재자의 사이트 특정 표현에 관하여 추가 질문에 대답할 수 있습니다. 피릭산과 파라포름알데히드는 위험합니다. 연기 후드에 두 화학 물질과 함께 작업, 개인 보호 복과 장갑을 사용하고 처리 후 얼굴과 손을 씻어.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

연구

면역학 및 감염병학

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...