Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde NIH-AR047410 (KEM)

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Inflamação induzida por carrageenano (C-II)
<ol><li>Anestesize ratos machos e/ou fêmeas Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de idade) com isoflurane (ou anestésico injetável).</li>
<li>Verifique a profundidade da anestesia tocando a córnea e apertando levemente a pata traseira esquerda. Quando o animal estiver apropriadamente anestesiado, nenhuma re...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. 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B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. 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L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

O estudo determinou que a epiderme da pele de pata traseira de rato foi facilmente separada da derme usando termolise (0,5 mG/mL) em PBS com cloreto de cálcio de 1 mM a 4 °C por 2,5 h. A avaliação histológica indicou que a epiderme foi separada da derme na membrana do porão e que as cristas de rete epidérmicas estavam intactas. Termolysina é um metalloendopeptidase extracelular produzido por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Sua atividade é estável a 4 ...

A avaliação de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos da pele pode ser limitada devido à heterogeneidade dos tipos celulares encontrados na derme inflamada e epiderme1,2,3. Várias enzimas, técnicas químicas, térmicas ou mecânicas envolvendo separação das duas camadas ou para a realização da dissociação celular para avaliação foram revisadas recentemente4. Ácido, álcali, sal neutro e calor podem dividir a epiderme da derme rapidamente, mas o inchaço celular e extracelular geralmente ocorre5,6. Tripo, pancreatina, descamefástase, keratinase, colagenase, pronase, dispase e termolise são enzimas que foram usadas para separação epidérmico-dérmica4,7. Trippsina e outras enzimas proteolíticas de larga escala estão ativas a 37-40 °C, mas devem ser monitoradas cuidadosamente para evitar a dissociação de camadas epidérmicas. Dispase corta a epiderme na lamina densa, mas requer 24h para separação no frio4,8 ou pontos de tempo mais curtos a 37 °C4,9. Uma característica limitante de todas essas técnicas é a potencial interrupção da morfologia tecidual e perda de integridade de mRNA e proteína.
Para manter a integridade do mRNA e da proteína, um método de separação da pele deve ser realizado no frio por um curto período de tempo. Na avaliação das técnicas de separação da pele para estudos de inflamação, a termolise é uma enzima eficaz para separar a epiderme da derme a temperaturas frias4. A termolise está ativa a 4 °C, corta hemidesmosmosomos epidérmicos da lamina lucida, e separa a epiderme da derme dentro de 1-3 h4,8,10. O objetivo deste relatório é otimizar o uso de termolysina para separação de epiderme inflamada de ratos inflamados da derme para detectar níveis de mRNA e proteína para mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos. Vários relatórios preliminares foram apresentados11,12,13,14,15. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica ideal de separação da pele utilizando termolysina e demonstrar a detecção de 1) marcadores de inflamação, 2) interleucina-6 (IL-6) mRNA, e 3) mRNA e proteína na epiderme de ratos com inflamação induzida por carrageenano (C-II)16,17. Um relatório preliminar usando o modelo adjuvante completo da Freund indica que os níveis de MRNA e proteína ngf aumentam precocemente durante a inflamação15. Em camundongos, a sensibilização da pele com a aplicação tópica da oxazolona causa um aumento precoce no IL-6 mRNA usando a hibridização in situ36. Tanto o IL-6 quanto o NGF foram implicados em C-II18,19, mas não houve relatos que descrevam níveis de mRNA ou proteína para IL-6 ou NGF especificamente da epiderme durante os estágios agudos de C-II.
A técnica de termolise é barata e simples de executar. Além disso, a separação termolísina da epiderme da derme permite a análise mRNA, western blot e imunohistoquímica de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos durante o processo de inflamação15. Os pesquisadores devem ser capazes de usar facilmente essa técnica em estudos pré-clínicos e clínicos de inflamação cutânea.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

Técnicas fáceis de usar e baratas são necessárias para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotrophins durante lesões, inflamações e/ou sensibilização da pele. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo de separação epidérmico-dérmica usando termolysina, uma proteína que está ativa a 4 °C. Para ilustrar este procedimento, os ratos Sprague Dawley são anestesiados, e as patas traseiras direitas são injetadas com carrageenan. Seis e doze horas após a injeção, ratos com inflamação e ratos ingênuos são eutanizados, e um pedaço de pata traseira, pele glabrous é colocada no frio Dulbecco's Modified Eagle Medium. A epiderme é então separada na membrana do porão da derme por termolysina em PBS com cloreto de cálcio. Em seguida, a derme é protegida por fórceps de microdisseção, e a epiderme é gentilmente provocada. A coloração azul toluidina das seções teciduais mostra que a epiderme é separada limpamente da derme na membrana do porão. Todas as camadas celulares queratinócitos permanecem intactas, e as cristas epidérmicas de rete, juntamente com recuos de papilas dérmicas são claramente observadas. O RT-PCR qualitativo e em tempo real é usado para determinar o fator de crescimento nervoso e os níveis de expressão interleucina-6. Manchas ocidentais e imunohistoquímica são finalmente realizadas para detectar quantidades de fator de crescimento nervoso. Este relatório ilustra que a digestão da termolise fria é um método eficaz para separar a epiderme da derme para avaliação de alterações de mRNA e proteínas durante a inflamação.

A injeção de carrageenano na pata traseira do rato causou sintomas clássicos de inflamação, como vermelhidão e edema16,17. O inchaço da pata traseira foi medido com pinças mecânicas20. Um valor de linha de base da espessura da pata foi obtido para cada rato antes do tratamento carrageenano e medido novamente às 6h e 12 h. A espessura da pata aumentou significativamente em relação aos valores da linha de base<strong class="xfig"...

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Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Apresentado aqui é um protocolo para a separação da epiderme da derme para avaliar a produção de mediadores inflamatórios. Após a inflamação, a epiderme da pata traseira de rato é separada da derme por termolysina a 4 °C. A epiderme é então usada para análise de mRNA por RT-PCR e avaliação de proteínas por mancha ocidental e imunohistoquímica.

Separação de Epiderme de Rato e Derme com Termolise para Detectar mRNA inflamatório específico do local e proteína

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Nosso protocolo é uma técnica de separação epidérmico-dérmica fácil de usar e barata para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotropinas durante a inflamação da pele. A principal vantagem dessa técnica é que a separação enzimática da epiderme da derme é realizada a quatro graus Celsius, mantendo a integridade do mRNA e da proteína. Este método fornece uma visão dos tipos de mediadores que sensibilizam terminais primários diferentes durante inflamações agudas e crônicas para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.Cicatrização de feridas, doenças da pele, feridas crônicas e queimaduras podem se beneficiar desta pesquisa. E esse método poderia ser aplicado a outras superfícies epiteliais, como o trato GI e a córnea. O tempo ideal de separação pode diferir ligeiramente entre os laboratórios.Recomenda-se um experimento preliminar comparando diferentes pontos de tempo combinados com uma avaliação de morfologia 2D para determinar a qualidade da separação. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato Sprague Dawley de oito a nove semanas de idade, injete subcutânea a pata traseira glabrous direita com 100 microliters de 1X Lambda carrageenan diluído na PBS. Use pinças para medir a espessura metatarsal da pata traseira imediatamente antes e às 6 e 12 horas após a injeção para determinar o volume de edema em resposta ao estímulo.No ponto final experimental apropriado, use um bisturi afiado para colher um pedaço de uma por dois milímetros de pele de pata traseira glabrous da pata injetada e use fórceps de microdisseção para transferir a pele em um mililitro de DMEM frio em um tubo de microcentrifuge no gelo por 15 a 60 minutos. Enquanto o tecido está incubando, adicione um mililitro de termolysina ativada recém-preparada a 10 poços de uma placa de cultura celular de 24 poços no gelo. Ao final da incubação, utilize os fórceps de microdisseção para transferir uma amostra de pele para cada poço de termolysina ativada, estrato corneum lado para cima sem imergir as amostras na solução.É fundamental que a pele não esteja imersa na termolise e que o estrato corneum enfrente para alcançar uma separação eficaz. Após duas a três horas, use os fórceps de microdisseção para imergir uma amostra de pele em sete a oito mililitros de quatro graus Celsius DMEM em uma placa de Petri para permitir mais espaço para a epiderme se separar da derme. Use fórceps para escovar suavemente a epiderme ao redor do perímetro da pele até que a epiderme quase translúcida seja observada nas bordas da amostra.Quando a epiderme se separa visivelmente da derme, segure cuidadosamente cada camada da pele com um único par de fórceps e puxe lentamente a epiderme da derme, então avalie a translucência da epiderme isolada por microscopia leve para garantir que ela seja opticamente consistente. Se as camadas tiverem sido devidamente separadas, coloque os tecidos epidérmicos e dérmicos em recipientes individuais de cinco milimalmente EDTA em DMEM a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a desativação da termolise, fixar uma parte da epiderme em um fixador apropriado por uma hora em temperatura ambiente com agitação.Ao final da incubação, coloque o tecido fixo em 10% de sacarose em PBS durante uma hora em temperatura ambiente com agitação, antes de congelar a amostra em uma matriz adequada de incorporação de tecido para secção. Use um criostat para obter seções transversais de 14 micrômetros de espessura e descongelar as seções em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina. Depois de secar em um aquecedor de slides, manche as amostras com uma solução de trabalho de azul toluidina por 90 segundos.Depois, lave suavemente o azul toluidina dos slides com PBS e oponha a deslizamentos com um meio de montagem aquoso, em seguida, observe a epiderme com microscopia Brightfield a uma ampliação de 50 a 250X. A injeção de carrageenano na pata traseira do rato causa sintomas clássicos de inflamação, como vermelhidão e edema em 6 e 12 horas após a injeção. A microscopia brightfield pode ser usada para avaliar a eficácia da separação termolise da epiderme e derme da pele da pata traseira glabrous ratazana.De fato, a coloração azul toluidina das seções transversais epidérmicas mostra que a epiderme está separada da derme na membrana da linha de base, mas que as cristas epidérmicas de Rete e as recuos da papila dérmica permanecem intactas. Além disso, todas as camadas celulares queratinadas são observadas. A mancha ocidental da epiderme separada da termolise produz resultados consistentes, indicando níveis de proteínas estáveis durante a técnica a quatro graus Celsius.Muito pouca proteína NGF é detectada na epiderme de ratos ingênuos, mas os níveis de proteína NGF são significativamente elevados após seis horas de inflamação induzida por carrageenano. 12 horas após a injeção, os níveis de NGF são reduzidos em comparação com os observados em seis horas, mas permanecem elevados em relação aos controles. Como esperado da análise de manchas ocidentais, a imunoreatividade NGF não é detectada em amostras de tecido de epiderme de controle ingênuo, mas em seis horas de inflamação pós-carrageenana induzida, a imunoreatividade NGF é observada na maioria dos queratinócitos do estrato granuloso e estrato lúdico.Algumas células no spinosum estrato também são imunoreativas NGF. Ao usar termolise para isolar a epiderme intacta, é importante lembrar que o tempo ideal de separação deve ser determinado empiricamente pelo usuário final. Várias técnicas proteômicas e moleculares podem ser usadas para validar a expressão de proteínas específicas e/ou transcrições genéticas primárias para confirmar que este procedimento não altera a expressão basal.Esta técnica de separação epidérmico-dérmica permitirá aos pesquisadores responder a perguntas adicionais sobre a expressão específica do local de neurotrophins e mediadores inflamatórios em diferentes modelos inflamatórios cutâneos. Ácido picrico e paraformaldeído são perigosos. Trabalhe com ambos os produtos químicos em um capô de fumaça, use roupas de proteção pessoal e luvas e lave o rosto e as mãos após o manuseio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Imunologia e Infecção

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

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Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...