Name: separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

Bu araştırma için fon Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH-AR047410 (KEM) tarafından sağlanmıştır.

Bu protokol Oklahoma Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi IACUC'nin (#2016-03) hayvan bakım yönergelerini takip etmektedir.
1. Karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II)
<ol><li>Erkek ve/veya dişi Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g; 8-9 haftalık) izofluran (veya enjekte edilebilir anestezi) ile uyuşturmak.</li>
<li>Korneaya dokunarak ve sol arka pençeyi hafifçe kıstırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvan uygun şekilde uyuşturuldığında, kornea veya pe...

<ol>
	<li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+neurogenic+inflammation.">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li><li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy.">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li><li>Sch&#228;kel, K., Sch&#246;n, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+psoriasis.">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift f&#252;r Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li><li>Zou, Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal-epidermal+separation+methods:+research+implications.">Dermal-epidermal separation methods: research implications.</a> Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).</li><li>Baumberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+separation+of+epidermis+from+dermis+and+some+physiologic+and+chemical+properties+of+isolated+epidermis.">Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).</li><li>Felsher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+adherence+of+the+epidermis+to+the+corium.">Studies on the adherence of the epidermis to the corium.</a> Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).</li><li>Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes.">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li><li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+keratinocyte+isolation:+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase.">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li><li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis.">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li><li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation.">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation:+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization.">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li><li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin:+evaluation+of+corneal+afferents.">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).</li><li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-property+relationship+of+skin.">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).</li><li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions.">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+(AIA):+A+temporal+study.">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).</li><li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat.">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li><li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+inflammation:+Carrageenan-+or+complete+Freund's+Adjuvant+(CFA)-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat.">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2012).</li><li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK/p38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema.">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li><li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse:+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li><li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat.">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision.">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).</li><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1,+in+the+rat+dorsal+ganglion.">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li><li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation.">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).</li><li>van den Burg, B., Eijsink, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+and+related+Bacillus+metallopeptidases.">Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases.</a> Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin.">Thermolysin.</a> Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).</li><li>Hybbinette, S., Bostr&#246;m, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li><li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol.">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li><li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+culture+of+mammalian+cells.">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation.">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li><li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair.">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li><li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex.">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li><li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin,+eicosanoids,+platelet-activating+factor,+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors.">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li><li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons.">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li><li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms.">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li><li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+(TNF-alpha)+and+interleukin+6+(IL-6)+following+skin+sensitization.">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li><li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts.">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).</li></ol>

Çalışma, sıçan arka pençesi glabrous derisinin epiderminin PBS'de termolysin (0,5 mG/mL) kullanılarak dermisten 2,5 saat boyunca 4 °C'de 1 mM kalsiyum klorür ile kolayca ayrıldığını belirledi. Histolojik değerlendirmede epidermisin bodrum zarındaki dermisin arasından ayrıldığı ve epidermal rete sırtlarının sağlam olduğu belirtilmiştir. Thermolysin, Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24tarafından üretilen hücre dışı bir metalloendopepti...

İltihaplı dermis ve epidermis 1,2,3'tebulunan hücre tiplerinin heterojenliği nedeniyleinflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin deriden değerlendirilmesi sınırlanabilir. İki katmanın ayrılmasını veya değerlendirme için hücre ayrıştırmasını içeren çeşitli enzimler, kimyasal, termal veya mekanik teknikler yakın zamanda gözden geçirilmiştir4. Asit, alkali, nötr tuz ve ısı epidermisi dermisten hızlı bir şekilde ayırabilir, ancak hücresel ve hücre dışı şişlik genellikle5,6. Tripsin, pankreas, elastaz, keratinaz, kollajenaz, pronaz, dispaz ve termolysin epidermal-dermal ayırma için kullanılan enzimlerdir4,7. Tripsin ve diğer geniş ölçekli proteolitik enzimler 37-40 °C'de aktiftir, ancak epidermal tabakaların ayrışmasını önlemek için dikkatlice izlenmelidir. Dispaz epidermisi lamina densa'da ayırır, ancak soğukta ayırma için 24 saat gerektirir4,8 veya daha kısa zaman noktalarında 37 °C4,9. Tüm bu tekniklerin sınırlayıcı bir özelliği, doku morfolojisinin potansiyel bozulması ve mRNA ve proteinin bütünlüğünü kaybetmesidir.
mRNA ve protein bütünlüğünü korumak için soğukta kısa bir süre cilt ayırma yöntemi yapılmalıdır. İltihaplanma çalışmaları için cilt ayırma tekniklerinin değerlendirilmesinde, termolisin epidermisi soğuk sıcaklıklarda dermisten ayırmak için etkili bir enzimdir4. Thermolysin 4 °C'de aktiftir, epidermal hemidezmosomes'ı lamina lucida'dan ayırır ve epidermisi 1–3 h 4,8,10içinde dermisten ayırır. Bu raporun amacı, iltihaplı mediatörler ve nörotrofik faktörler için mRNA ve protein seviyelerini tespit etmek için iltihaplı sıçan epidermisinin dermisten ayrılması için termolizin kullanımını optimize etmektir. Çeşitli ön raporlar11 , 12,13,14,15. Bu makalenin amacı termolisin kullanarak optimal bir cilt ayırma tekniğini tanımlamak ve 1) inflamasyon belirteçlerinin, 2) interlökin-6 (IL-6) mRNA'nın ve 3) karragenan kaynaklı inflamasyon (C-II)16,17olan sıçanların epiderminde sinir büyüme faktörü (NGF) mRNA ve proteinin tespitini göstermektir. Freund'un adjuvan modelinin tamamını kullanan bir ön rapor, NGF mRNA ve protein seviyelerinin iltihaplanma sırasında erken arttığını gösterir15. Farelerde, oksazolonun topikal uygulaması ile cilt duyarlılığı, in situ hibridizasyon36kullanarak IL-6 mRNA'da erken bir artışa neden olur. Hem IL-6 hem de NGF, C-II18,19'akarışmıştır,ancak C-II'nin akut aşamalarında özellikle epidermisin epidermisinden IL-6 veya NGF için mRNA veya protein seviyelerini açıklayan hiçbir rapor olmamıştır.
Termolysin tekniği ucuz ve basittir. Ayrıca, epidermisin dermisten termoliz ayrılması, iltihaplanma sürecinde mRNA, batı lekesi ve inflamatuar mediatörlerin ve nörotrofik faktörlerin immünohistokimyasal analizine izin verir15. Araştırmacılar bu tekniği cilt iltihabının hem klinik öncesi hem de klinik çalışmalarında kolayca kullanabilmelidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#955;-carrageenan</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>22049</td>
			<td>Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4351107</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>499609</td>
			<td>Prevents autolysis of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C0612</td>
			<td>Aqueous mounting medium after toluidine blue staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Secondary antibody for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11966-025</td>
			<td>To maintain tissue integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Stops thermolysin reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td>For complementary DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NGF Antibody (E-12)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365944</td>
			<td>For neurotrophin immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>To retard immunofluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PGP 9.5</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL7756AP</td>
			<td>For intraepidermal nerve staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code 400</td>
			<td>Animal used for inflammation studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1310TS</td>
			<td>Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472908</td>
			<td>For RT-PCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T7902</td>
			<td>From Geobacillus stearothermophilus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>89640</td>
			<td>For tinctorial staining for brightfield microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For total RNA extraction for RTPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of rat epidermis and dermis with thermolysin to detect site-specific inflammatory mrna and protein

Cilt hasarı, iltihaplanma ve/veya duyarlılık sırasında enflamatuar mediatörlerin ve nörotrofinlerin bölgeye özgü üretimini belirlemek için kullanımı kolay ve ucuz tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmanın amacı, 4 °C'de aktif olan bir proteinaz olan termolysin kullanılarak epidermal-dermal ayırma protokolünü tanımlamaktır. Bu prosedürü göstermek için, Sprague Dawley sıçanları uyuşturulur ve sağ arka pençelere karragenan enjekte edilir. Enjeksiyondan altı ve on iki saat sonra, iltihaplı ve naif sıçanlara sahip sıçanlar ötenaziye tabir edilir ve soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'na bir parça arka pençe, glabrous derisi yerleştirilir. Epidermis daha sonra bodrum zarında pbs'de termolysin ile dermisten kalsiyum klorür ile ayrılır. Daha sonra, dermis mikrodiseksiyon tokmaları ile sabitlendirilir ve epidermis hafifçe alay edilir. Doku bölümlerinin toluidin mavisi lekesi, epidermisin bodrum zarındaki dermisten temiz bir şekilde ayrıldığını göstermektedir. Tüm keratinosit hücre katmanları bozulmadan kalır ve epidermal rete sırtları ve dermal papilladan girintiler açıkça gözlenir. Sinir büyüme faktörünü ve interlökin-6 ekspresyon düzeylerini belirlemek için nitel ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanılır. Batı şişkinliği ve immünostokimya nihayet sinir büyüme faktörü miktarlarını tespit etmek için gerçekleştirilir. Bu rapor, soğuk termolysin sindiriminin, iltihaplanma sırasında mRNA ve protein değişikliklerinin değerlendirilmesi için epidermisi dermisten ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Sıçan arka pençesine karragenan enjeksiyonu kızarıklık ve ödem gibi klasik iltihap belirtilerine neden oldu16,17. Arka pençenin şişmesi mekanik kaliperlerle ölçüldü20. Karragenan işlemden önce her sıçan için pençe kalınlığının temel değeri elde edildi ve tekrar 6 saat ve 12 saat olarak ölçüldü. Pençe kalınlığı taban çizgisi değerlerine göre önemli ölçüde arttırılmıştır (Ş...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein at JoVE.com

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Burada sunulan, enflamatuar mediatör üretimini değerlendirmek için epidermisin dermisten ayrılması için bir protokoldür. İltihaplanmadan sonra, sıçan arka pençe epidermisi 4 ° C'de termolysin ile dermisten ayrılır. Epidermis daha sonra RT-PCR ile mRNA analizi ve batı blot ve immünostokimyası tarafından protein değerlendirmesi için kullanılır.

Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Protokolümüz, cilt iltihabı sırasında enflamatuar mediatörlerin ve nörotrofinlerin bölgeye özgü üretimini belirlemek için kullanımı kolay ve ucuz bir epidermal-dermal ayırma tekniğidir. Bu tekniğin ana avantajı, epidermisin dermisten enzimatik olarak ayrılmasının dört santigrat derecede yapılması ve mRNA ve protein bütünlüğünün korunmasıdır. Bu yöntem, yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi için akut ve kronik inflamasyon sırasında birincil afferent terminalleri hassaslaştıran mediatör türleri hakkında fikir sağlar.Yara iyileşmesi, cilt hastalığı, kronik yaralar ve yanıklar bu araştırmadan yararlanabilir. Ve bu yöntem GI yolu ve kornea gibi diğer epitel yüzeylere uygulanabilir. En uygun ayırma süresi laboratuvarlar arasında biraz farklılık gösterebilir.Ayırmanın kalitesini belirlemek için 2D morfoloji değerlendirmesi ile birlikte farklı zaman noktalarını karşılaştıran bir ön deney önerilir. Uyuşturulmuş sekiz ila dokuz haftalık Sprague Dawley sıçanında pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, sağ glabrous arka pençesini PBS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre 1X Lambda karragenan ile deri altından enjekte edin. Uyarana yanıt olarak ödem hacmini belirlemek için enjeksiyondan hemen önce ve 6 ve 12 saat sonra arka pençe metatarsal kalınlığını ölçmek için kaliperler kullanın.Uygun deneysel uç noktada, enjekte edilen pençeden bir ila iki milimetrelik bir glabrous arka pençe derisi parçası toplamak için keskin bir neşter kullanın ve cildi 15 ila 60 dakika boyunca buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre soğuk DMEM'e aktarmak için mikroseksiyon forseps kullanın. Doku inkübe olurken, buz üzerinde 24 kuyulu bir hücre kültür plakasının 10 kuyusuna bir mililitre taze hazırlanmış aktif termolysin ekleyin. Kuluçkanın sonunda, mikrodiseksiyon forsepsini kullanarak her bir aktif termolysin kuyusuna bir deri örneği aktarın, stratum korneum, numuneleri çözeltiye batırmadan yukarı doğru.Cildin termolysin içine daldırılması ve stratum korneumun etkili bir ayrım elde etmek için karşı karşıya olması önemlidir. İki ila üç saat sonra, epidermisin dermisten ayrılması için daha fazla yer sağlamak için bir petri kabına yedi ila sekiz mililitre dört santigrat derece DMEM'de bir cilt örneği daldırmak için mikrodiseksiyon forsepsini kullanın. Numunenin sınırlarında yarı saydam epidermisin yakını gözleninceye kadar epidermisi cildin çevresi etrafında hafifçe fırçalamak için epans kullanın.Epidermisin dermikten belirgin bir şekilde ayrılmasıyla, cildin her tabakasını tek bir çift önseziyle dikkatlice kavrayın ve epidermisi dermisin yavaşça çekin, ardından izole epidermisin yarı saydamlıklarını optik olarak tutarlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskopisi ile değerlendirin. Katmanlar düzgün bir şekilde ayrılmışsa, epidermal ve dermal dokuları DMEM'deki beş milimoler EDTA'nın tek tek kaplarına 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yerleştirin. Termolysin devre dışı kaldıktan sonra, epidermisin bir kısmını ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir fiksatifte sabitlayın.Kuluçkanın sonunda, numuneyi bölümleme için uygun bir doku gömme matrisine dondurmadan önce, sabit dokuyu Ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de% 10 sakkaroz içine yerleştirin. 14 mikrometre kalınlığında kesit elde etmek için bir kriyostat kullanın ve bölümleri jelatin kaplı cam mikroskop slaytlarına monte edin. Bir slayt ısıtıcı üzerinde kuruduktan sonra, örnekleri 90 saniye boyunca toluidin mavisi bir çalışma çözeltisi ile lekeleyin.Daha sonra, PBS ile slaytlardan toluidin mavisini hafifçe yıkayın ve sulu bir montaj ortamı ile kapaklara karşı çıkın, ardından 50 ila 250X büyütmede Brightfield mikroskopisi ile epidermisi gözlemleyin. Sıçan arka pençesine karragenan enjeksiyon, enjeksiyon sonrası hem 6 hem de 12 saat kızarıklık ve ödem gibi klasik iltihap belirtilerine neden olur. Brightfield mikroskopisi, sıçan glabrous arka pençe derisinin epidermisinin ve dermisinin termolisin ayrılmasının etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.Nitekim epidermal kesitlerin toluidin mavisi lekesi epidermisin taban çizgisi zarındaki dermisten ayrıldığını, ancak epidermal Rete sırtlarının ve dermal papilladan gelen girintilerin bozulmadan kaldığını göstermektedir. Ayrıca, tüm keratinosit hücre katmanları gözlenir. Termolysin ayrılmış epidermisin batı şişkinliği, teknik sırasında dört santigrat derecede kararlı protein seviyelerini gösteren tutarlı sonuçlar üretir.Naif sıçan epidermisinde çok az NGF proteini sapınır, ancak NGF protein seviyeleri altı saatlik karragenan kaynaklı iltihaplanmadan sonra önemli ölçüde yukarı yönlüdür. Enjeksiyondan 12 saat sonra, NGF seviyeleri altı saatte gözlenenlere kıyasla azalır, ancak kontrollere göre yüksek kalır. Batı blot analizinden beklendiği gibi, NGF immünoreaktivite naif kontrol epidermis doku örneklerinde saptanmaz, ancak karragenan kaynaklı inflamasyon sonrası altı saatte, stratum granülozum ve stratum lucidum keratinositlerinin çoğunda NGF immünoreaktivitesi görülür.Stratum spinosumdaki birkaç hücre de NGF immünoreaktiftir. Bozulmamış epidermisi izole etmek için termolisin kullanırken, en uygun ayırma süresinin son kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün bazal ifadeyi değiştirmediğini doğrulamak için belirli proteinlerin ve/veya birincil gen transkriptlerinin ekspresyonunun doğrulanabilir.Bu epidermal-dermal ayırma tekniği, araştırmacıların farklı kesitli enflamatuar modellerde nörotrofinlerin ve enflamatuar mediatörlerin bölgeye özgü ekspresyleriyle ilgili ek soruları yanıtlamalarını sağlayacaktır. Pikrik asit ve paraformaldehit tehlikelidir. Duman kaputunda her iki kimyasalla da çalışın, kişisel koruyucu giysiler ve eldivenler kullanın ve elleçlemeden sonra yüzünüzü ve ellerinizi yıkayın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...