Denne real-time RT-PCR er velegnet til hurtigt at diagnosticere rabies i præ-mortem og post mortem prøver. Pan-Lyssavirus primere er blevet optimeret til at identificere alle medlemmer af Lyssavirus slægten. Dette er en hurtig, følsom og lukket røranalyse, der påerer virus fra hele Lyssavirus slægten, herunder meget forskellige arter fra kliniske prøver.
OIE har for nylig accepteret molekylære analyser for at rapportere rabiesinfektion. Dette er især vigtigt for nedbrudte prøver, som ikke altid kan diagnosticeres ved viruskultur eller antigendetektionsmetoder. På grund af følsomheden af denne analyse, god laboratoriepraksis, herunder adskillelse af de forskellige stadier er afgørende for at minimere risikoen for forurening.
Demonstrationen af proceduren vil være Daisy Jennings, en diagnostiker fra mit laboratorium. Start med at kvantificere RNA med et mikrovolumenspektrofotometer. Sørg for, at maskinen er indstillet til RNA og bruge en til to mikroliter molekylærkvalitet vand til at normalisere maskinen og etablere en baseline.
Mål RNA-koncentrationen, og juster den til et mikrogram pr. mikroliter. Planlæg layoutet af din PCR-plade med et regneark, der tager højde for både test- og kontroleksempler. Forbered en PCR-arbejdsstation ved at desinficere overflader, og hvis du bruger et UV-skab, tændes UV-lyset 10 minutter før start.
Fjern reagenser og primere fra fryseren for at tø op, men hold altid enzymblandingen på is. Reagenserne blandes og centrifugeres kortvarigt for at opsamler væsken. Forbered PCR master mix til Lyssavirus og Beta-Actin i henhold til manuskriptet retninger.
Lad masterblandingerne på isen, indtil den er klar til brug. Bland og centrifuger de forberedte masterblandinger og dispenseres 19 mikroliter i de relevante brønde i PCR-maskinkompatibel plade eller rørstrimmel. I et separat rum eller et UV-skab skal du forsigtigt tilføje en mikroliter af det forberedte RNA.
Hvis du bruger et UV-skab, skal du tænde for UV-lyset 10 minutter før start. Efter testprøverne skal du tilføje det positive kontrolelement og kontrolelementet ingen skabelon. Når du tilføjer RNA'et til masterblandingerne, skal du sikre dig, at det er føjet til den korrekte brønd.
Brug en plade plan for at støtte dette trin. Forsegle pladen kontrollere, at lågene er flade på tværs af pladen og drej den ned for at indsamle al væske i bunden af brøndene. Sørg for, at hver brønd har samme mængde væske, og at der ikke er synlige bobler.
Overfør derefter prøverne til PCR-maskinen. Åbn programmet vælge SYBR Green med dissociation. Vælg de brønde, der skal analyseres vælge ukendt som prøven type og SYBR som fluorescerende farvestof.
Mærke brøndene på pladen layout med prøven oplysninger, herunder om analysen er for Lyssavirus L eller Beta-Actin. Klik på termoprofilopsætningen og rediger de termiske cykelforhold som angivet i manuskriptet. Klik på Start, vælg derefter en placering for at gemme filen, og markér afkrydsningsfeltet for at slukke lampen i slutningen af kørslen.
Når muligheden for at starte, før lampen opvarmning vises, skal du klikke køre nu, men sørg for, at lampen har mindre end 15 minutter til at varme op. Når PCR-kørslen er fuldført, skal du fortsætte med dataanalyse. Først analysere Lyssavirus forstærkning plots.
Positive prøver viser eksponentielle ramper, mens negative prøver har flade forstærkningsområder uden CT-værdier. Dernæst analysere lyssavirus dissociation kurve resultater af testprøver sammen med kontrolprøverne. En Lyssavirus positiv prøve vil have en smeltetemperatur mellem 77 og 80 grader Celsius og overlapper med den positive kontrol.
Derefter analyseres Beta-Actin forstærkningsområder og dissociationskurver, der sammenligner med kontrollerne for at fortolke det samlede resultat. Få vist tekstrapporten, og brug oplysningerne til at registrere de CT- og TM-værdier, der er opnået for kontrol-RNA'et, på et kontrolkort for at bekræfte, at kørslen lykkedes, og at testeksempelresultaterne kan rapporteres. Denne protokol bruges til at demonstrere følsomheden af Pan-Lyssavirus RT-PCR på en RNA fortynding serie af en kontrol standard virus.
Forstærkningskurven angiver, at der kan detekteres så lidt som 10 picogrammer lyssavirus, og at dissociationskurverne kontrollerer produktets smeltetemperatur. Smeltetemperaturen bruges til at bekræfte, at amplicon er lyssavirus specifik. Resultaterne her viser en smeltende temperaturområde på tværs af Lyssavirus slægten på 77,34 til 79,67 grader Celsius.
Smeltetemperaturværdier under 76,8 eller over 80,2 betragtes som ikke-specifikke. Følsomheden af denne RT-PCR-analyse bestemmes også ved at detektere RNA fra tre Lyssavirus positive hjerneprøver. Så lidt som 0,1 picogram per mikroliter af mål RNA kan påvises for to ud af de tre prøver.
Især, repræsentanter fra alle anerkendte Lyssavirus arter påvises ved hjælp af denne analyse. Hvis analyse af RNA-ekstrakter fra kliniske prøver såsom spyt eller CSF, kan Beta-Actin-resultaterne være negative på grund af mangel på værtskernesyrer. Tilføjelsen af et eksogent kontrolelement kan løse dette problem.
Sekvensering af lyssavirus positive prøver anbefales at give yderligere oplysninger om den geografiske og vært oprindelse af en rabiesinfektion. Håndtering af lyssavirus positive eller formodede positive prøver skal ske i overensstemmelse med lokale retningslinjer for sundhed og sikkerhed. Det udtrukne RNA er ikke-infektiøs, derfor kan håndteres i lav indeslutning laboratorier.
