Name: pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis at JoVE.com

De auteurs willen Miss Emma Wise en Miss Megan Golding bedanken voor hun hulp bij het afronden van de experimenten. De ontwikkeling van dit protocol werd financieel gesteund door het Britse ministerie van milieu, voedsel en Plattelandszaken (DEFRA), de Schotse regering en de regering van Wales door subsidies [SV3500 en SE0431] en door het Europese virus Archive Global (EVAg) project dat financiering ontvangen uit het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 653316.

Monsters van diagnostisch materiaal dat na een natuurlijke infectie bij APHA is ontvangen, of verkregen door het inoculeren van muizen met behulp van protocollen die zijn beoordeeld door het Comité ethiek en statistiek van de UK onder licentie 70/7394.
1. kwantificering van RNA met behulp van een micro volume spectrofotometer
<ol><li>Zorg ervoor dat de instellingen van de spectrofotometer op RNA zijn ingesteld.</li>
	<li>Gebruik 1-2 μL moleculair water om de machine te initialiseren en een basislijn in te stellen.</li>
	<li>Gebruik 1-2 μL van elk test-RNA-monster om de RNA-hoeveelheid te beoordelen.</li>
	<li>Sla de lezingen en het document op.</li>
	<li>Stel het RNA zo nodig in op 1 μg/μL. Opmerking: RNA moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden bewaard. Als RNA wordt verkregen met behulp van een kolom of een op kraal gebaseerde methode, is het RNA meestal minder dan 1 μg/μL. In deze situatie gebruik maken van de RNA netjes.</li>
</ol>2. bereiding van RNA-verdunningsreeks om de gevoeligheid van het eindpunt te bepalen
<ol><li>
Maak een 10-voudige seriële verdunning van het RNA.
	<ol>
<li>Etiket buizen met de verdunningsreeks (bijv. 10-1, 10-2, enz.) en de RNA-gegevens.</li>
		<li>Voeg 45 μL moleculair water toe aan elke buis.</li>
		<li>Voeg 5 μL RNA (voorheen verdund tot 1 μg/μL) toe en meng goed.</li>
		<li>Gooi de pipetpunt weg in een geschikt ontsmettingsmiddel en vervang deze door een nieuwe tip.</li>
		<li>Neem 5 μL van de 10-1 en voeg toe aan 10-2 buis en meng goed.</li>
		<li>Herhaal 2.1.3-2.1.5 met de resterende verdunningen. Opmerking: RNA moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden bewaard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. voorbereiding van real-time RT-PCR-reacties
<ol><li>Gebruik een werkblad om de plaat indeling te plannen volgens het aantal test monsters en controlemonsters, zowel voor het Lyssavirus als het ß-actin-assays. Opmerking: Als 4 monsters moeten worden getest in tweevoud met een positieve en negatieve controle, komt dit neer op 10 Reacties voor beide assays.</li>
	<li>Veeg in een ' schone ruimte ' of een gebied dat losstaat van het RNA-template de oppervlakken af met een geschikt ontsmettingsmiddel vóór gebruik of maak een PCR-werkstation (indien gebruikt). Om het werkstation voor te bereiden, veegt u het oppervlak van de kast af met een geschikte desinfectie en plaatst u de benodigde items in het werkstation en sluit u de deuren. Het UV-licht gedurende 10 minuten inschakelen</li>
	<li>Verwijder regenten en primers uit de vriezer en ontdooien (reagentia vermeld in tabel 1 en primers in tabel 2). Opmerking: Het enzym mengsel wordt opgeslagen in glycerol, dus niet ontdooien en moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden gehouden. Alle andere reagentia kunnen op kamertemperatuur ontdooid worden.</li>
	<li>Meng de reagentia eenmaal ontdooid en centrifugeer kort om vloeistof te verzamelen. Opmerking: Draai het enzym mengsel niet Vortex, centrifugeer gewoon kort.</li>
	<li>Bereid afzonderlijke Master mixen voor Lyssavirus en ß-actin. Voeg voor elke reactie 7,55 μL moleculair water, 10 μL van 2x universele SYBR groene reactiemix, 0,6 μL voorwaartse primer, 0,6 μL omgekeerde primer, 0,25 μL iTaq RT enzym mengsel.
	<ol>
<li>Gebruik een werkblad om de juiste volumes te berekenen om fouten in handmatige berekeningen te voorkomen. Zorg ervoor dat voldoende Master-Mix is voorbereid om te compenseren voor Pipetteer fouten. Dus als 10 Reacties nodig zijn (zie opmerking in 3,1), bereid 12 Reacties</li>
		<li>Bereid de Master-mix op ijs (of in een koelblok) en blijf op ijs totdat het in de real-time machine wordt geplaatst.</li>
	</ol></li>
	<li>Meng de bereide meester mixen, centrifugeer kort en breng 19 μL in de relevante putten van strook buizen of een 96 goed plaat compatibel met de real-time machine in gebruik. Opmerking: Minimaliseer de productie van bellen in de putjes tijdens het pipetteren.</li>
	<li>Voeg in een aparte ruimte, of in een UV-kast die is bereid zoals beschreven in 3,2, voorzichtig 1 μL van het RNA toe dat eerder is afgesteld op 1 μg/μL (zie stap 1,5) onder het oppervlak van de juiste Master-Mix goed en meng zachtjes. Gooi de pipetpunt direct na gebruik weg in een ontsmettingsmiddel (onder het oppervlak).
	<ol>
<li>Voeg de besturingselementen toe na de test voorbeelden, met de volgende positieve controle en het besturingselement geen sjabloon (NTC – moleculair niveau water) dat als laatste is toegevoegd. De hoeveelheid RNA die wordt gebruikt, kan worden gewijzigd afhankelijk van het type monster en de gebruikte RNA-extractie. De gebruikte hoeveelheid moet worden gevalideerd om ervoor te zorgen dat de reactie wordt geoptimaliseerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Afdichtings plaat met behulp van strip deksels of sealer zorg ervoor dat alle deksels stevig zijn gesloten en voldoende geëtiketteerd om de monsters te oriënteren. Label de rand van de plaat/strook buizen.</li>
	<li>Draai de monsters met behulp van een centrifuge om alle vloeistof op de bodem van de putjes te verzamelen.</li>
	<li>Transfer plaat naar de real-time PCR-machine, open de deur en plaats in de houder en zorg voor de juiste locatie/oriëntatie van de monsters volgens de plaat indeling. Opmerking: Als er buis stroken worden gebruikt, controleer dan of de houder op zijn plaats is.</li>
	<li>Open het real-time PCR-machine programma en kies de optie voor SYBR real-time experiment met dissociatie curve. Program meer de real-time PCR-machine met behulp van de thermische fiets condities zoals aangegeven in tabel 3, inclusief de gegevens inzamelingspunten.</li>
	<li>Selecteer Sybr als de fluorescerende kleurstof en selecteer onbekend als het sample type en voeg een naam in de juiste voorbeeld naam doos. Opmerking: Onderscheid tussen de replicaten en ook tussen de Lyssavirus en ß-actin Wells.</li>
	<li>Kies een bestandslocatie om de experimentele gegevens op te slaan, zorg ervoor dat de lamp aan het einde van de hardloopsessie wordt uitgeschakeld en start de hardloopsessie. Opmerking: Aangezien de eerste stap een RT-fase is, worden er gedurende deze tijd geen gegevens verzameld, dus als de lamp een warming-upperiode vereist, kan dit tijdens de RT-fase plaatsvinden. De real-time machine en software zullen de versterkings curves in real-time weergeven, terwijl de smelt curve wordt gegenereerd aan het einde van de cyclus.</li>
</ol>4. gegevensanalyse
<ol><li>
Als de uitvoering is voltooid, voert u de gegevensanalyse als volgt uit.
	<ol>
<li>Analyseer eerst de versterkings plot resultaten van de test monsters naast de controlemonsters. Positieve monsters tonen exponentiële hellingen, meestal gevolgd door plateau en een Ct -waarde. Negatieve monsters bevatten vlakke versterkings percelen zonder Ct -waarden (Figuur 1a). De Ct -waarde wordt automatisch berekend door de software, hoewel dit moet worden gecontroleerd en handmatig worden gewijzigd indien nodig.</li>
		<li>Ten tweede analyseert u de resultaten van de dissociatie curve van de test monsters naast de controlemonsters. Een positief monster zal een smelttemperatuur (Tm) 77 – 80 °c hebben en overlappen met de positieve controle Figuur 1b).</li>
		<li>Verkrijg het algemene diagnostische resultaat door ervoor te zorgen dat de besturingselementen geldig zijn. Gebruik tabel 4 om de resultaten te interpreteren in relatie tot het interne ß-actin-besturingselement. Als de positieve controlemonsters negatief zijn en/of de negatieve monsters positief zijn, moet de uitvoering buiten beschouwing worden gelaten.</li>
		<li>Noteer de Ct -en tm -waarden die zijn verkregen voor het controle-RNA in een ' controlekaart ' om trendanalyse mogelijk te maken en om Drifts in de gevoeligheid van de assay te helpen identificeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE.">OIE.</a> OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).</li><li>Panning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+rabies+virus+reverse+transcription-PCR+and+virus+isolation+using+samples+from+a+patient+infected+with+rabies+virus.">Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).</li><li>Wakeley, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time,+TaqMan+reverse+transcription-PCR+assay+for+detection+and+differentiation+of+lyssavirus+genotypes+1,+5,+and+6.">Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SYBR-green+I+quantitative+real-time+reverse+transcription-PCR+assay+for+rabies+viruses+with+different+virulence.">A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence.</a> Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).</li><li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+Assay+for+the+Detection+of+Highly+Variable+Rabies+virus+and+Other+Lyssaviruses.">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).</li><li>Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+real-time+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+methods+for+human+rabies+diagnosis.">Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).</li><li>Hoffmann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+safety+for+molecular+diagnosis+of+classical+rabies+viruses+by+use+of+a+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+&#34;double+check&#34;+strategy.">Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR &#34;double check&#34; strategy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).</li><li>Faye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+sensitive+real-time+RT-PCR+assay+for+broad+detection+of+rabies+virus.">Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus.</a> Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).</li><li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Combined+Real-Time+Reverse+Transcription+Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+the+Diagnosis+of+Lyssavirus+Infection.">Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>Marston, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ikoma+lyssavirus,+highly+divergent+novel+lyssavirus+in+an+african+civet.">Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet.</a> Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).</li><li>. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33) Available from: <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy/">https://talk.ictvonline.org/taxonomy/</a> (2018)</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hayman, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses.">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li><li>Calisher, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+relationships+among+rhabdoviruses+from+vertebrates+and+hematophagous+arthropods.">Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods.</a> Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).</li><li>Aznar-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rhabdovirus+viral+RNA+in+oropharyngeal+swabs+and+ectoparasites+of+Spanish+bats.">Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats.</a> Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven pan-Lyssavirus real-time RT-PCR-test is een gesloten buis, één stap test die lyssavirussen in alle drie phylogroepen detecteert. De test is gevalideerd voor de diagnose van zowel dier-als humane rabiës, waaronder postmortemse hersenweefsel (optimaal hersenstam) en antemmortem monsters zoals huid biopsie, in serie verzamelde speeksel of cerebrale spinale vloeistof (CSF). De primers die in deze test werden gebruikt, werden voor het eerst ontworpen en gebruikt voor een sonde-gebaseerde assay om onderscheid te maken tussen RABV, EBLV-1 en EBLV-23, die in veel OIE-rabiës laboratoria is gebruikt en consistent presteert in de EURL-bekwaamheids schema's. Vervolgens is het ' pan-lyssavirus'-karakter van deze primers bevestigd met behulp van een 2-stappen real-time assay15. De hier beschreven bepaling heeft de primers gebruikt om de RT-PCR verder te optimaliseren in een éénstsluitende SYBR-assay die een snel systeem met gesloten buizen mogelijk maakt. Bovendien heeft de opleiding in endemische landen met rabiës met behulp van deze test de geschiktheid bevestigd om in elk laboratorium met basis BESCHERMINGSmiddelen en kwaliteitssystemen te implementeren om kruisbesmetting en traceer monsters te verminderen, faciliteiten om de reagentia op te slaan en een real-time machine met SYBR-detectie. De assay is extreem robuust en heeft 100% correlatie met het vet, met verbeterde gevoeligheid voor afgebroken monsters3. Een van de belangrijkste voordelen voor een DNA-intercalciërende kleurstof analyse in vergelijking met een test op basis van een sonde is de relatieve kosten. Een bijkomend voordeel is dat de assay slechts twee primers gebruikt, waardoor er minder kans is op mislukte detectie vanwege sequentie divergentie, wat een zwakte is geweest in eerder gepubliceerde sonde-gebaseerde testen. Inderdaad, vertegenwoordigers van alle Lyssavirus soorten (afgezien van TWBLV en KBLV) worden gedetecteerd met behulp van deze test, en sequentieanalyse van TWBLV en KBLV over de primer sites onthult geen significante divergentie die sterk suggereert dat ze ook zullen worden gedetecteerd met behulp van Deze methode. Het bereik van de aantoonbaarheidsgrens die wordt waargenomen bij de geanalyseerde virussen, kan worden beschouwd als gevolg van twee belangrijke factoren. De eerste is dat het RNA werd geïsoleerd van klinisch hersen materiaal, daarom is de hoeveelheid genoom kopieën in elk onverdund monster niet direct vergelijkbaar. Het RNA werd ' genormaliseerd ' door het totaal RNA op 1 μg/μL aan te passen; echter, het aandeel van virale genoom RNA binnen dat monster zal variëren. De tweede is de diversiteit van Lyssavirus sequenties, ondanks de primer sites die zich in gecondengeerde regio's bevinden, blijven er posities van variatie. Daarom is het niet verwonderlijk dat de meerderheid van lyssavirussen met een lagere gevoeligheid voor de assay phylogroup II en III virussen zijn. De dissociatie curve analyse vertegenwoordigt een essentiële parameter, het minimaliseren van een vals positief resultaat dat anders zou kunnen optreden als gevolg van de vorming van primer dimers, of versterking van een niet-specifieke regio in de gastheer genoom. In werkelijkheid is dit een zeldzame gebeurtenis en de dissociatie curve analyse is equivalent aan het uitvoeren van een agarose-gel voor het visualiseren van de juiste grootte van conventionele RT-PCR-amplicons. Het bereik van acceptabele Tm -waarden is opgegeven (77-80 °c), op basis van de gegevens die in ons laboratorium zijn verzameld. Het wordt sterk aanbevolen dat individuele laboratoria in-House gegevens verzamelen om ervoor te zorgen dat het bereik overdraagbaar is en dienovereenkomstig wordt gewijzigd. De interpretatie van de resultaten van zowel de versterkings-als de dissociatie plots, naast de positieve en negatieve controles en de ß-actin resultaten, maakt robuuste en reproduceerbare diagnostische uitkomsten mogelijk.
Buiten het toepassingsgebied van dit protocol is de RNA-extractiemethode die wordt gebruikt om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen. Alle RNA geanalyseerd in dit protocol werd bereid met behulp van TRIzol; Er zijn echter veel geschikte op guanidium gebaseerde extracties RNA-extractie protocollen beschikbaar, inclusief op kolom en kraal gebaseerde extractie Kits. Het gebruik van Lyssavirus positieve (of vermoede) monsters moet binnen de erkende biocontainmentfaciliteiten binnen het land zijn. Echter, het totale RNA geëxtraheerd is niet-infectieuze, daarom behandeld binnen lage containment laboratoria. Afhankelijk van de gebruikte extractiemethode moet de vereiste om het RNA te kwantificeren en te verdunnen worden beoordeeld. Voor op fenol gebaseerde extracties, waaronder TRIzol, is deze stap vereist en voorkomt remming van de test tegen contaminerende gDNA; echter, kolom-en kraal-gebaseerde extracties (met name die met een DNA-depletie fase) vereisen geen verdunning voorafgaand aan het testen.
In het hele protocol is het essentieel dat zorg en toewijding worden gebruikt om kruisbesmetting en nauwkeurige toevoeging van monster aan de juiste putten te voorkomen. Een spreadsheet met de reagens berekeningen en plaat indeling is als aanvullend bestand beschikbaar om te downloaden. Goede laboratoriumpraktijken, waaronder schone werkoppervlakken, regelmatige veranderingen van handschoenen, het gebruik van barrière tips en verschillende kamers/UV-kasten om elke fase te scheiden, minimaliseren de kans op verontreiniging. Om ervoor te zorgen dat de test met de verwachte parameters presteert, moeten positieve en negatieve controles worden opgenomen en worden alle test monsters in tweevoud (of drie) uitgevoerd.
Het opnemen van controles is een essentieel kenmerk van elke PCR, met name voor diagnostiek. Positieve controle RNA werd bereid uit CVS (Challenge virus Standard) geïnfecteerde muizenhersenen in batches en gevalideerd en gekalibreerd om consistentie tussen batches te garanderen. Het RNA van de controle werd gekwantificeerd en verdund tot 1 μg/μL. RNA waarvoor een positief resultaat werd verkregen in een seriële verdunning tot ten minste 10-4 (gelijk aan 100 PG/μl) werd geschikt geacht voor het beoogde doel. De positieve controle RNA werd opgeslagen bij-80 °C in 10-1 aliquots. Indien nodig werd een aliquot verdund tot 1:100 voor een werkende kolf van 1 ng/μL en opgeslagen bij-80 °C in 5 μL enkelvoudige aliquots voor eenmalig gebruik. De verdunde positieve controle RNA werd gebruikt om lage positieve monsters te vertegenwoordigen, en om ervoor te zorgen dat elke vermindering van de gevoeligheid van de assay werd gedetecteerd. Voor elke controle werd een ' controlekaart ' bijgehouden om de Ct -waarden te bewaken en trends te identificeren (tabel 5). Tabel 5 toonde een goede onderlinge vergelijkbaarheid voor de CVS-positieve controlemonster CT -en tm -waarden over meerdere dagen en exploitanten, met de verzekering dat de test robuust en reproduceerbaar is. De resultaten die afwijken van deze metingen moeten worden onderzocht en indien nodig moeten test monsters worden herhaald. Moleculair water werd bij elke run opgenomen als een NTC om te bevestigen dat de reagentia vrij waren van besmetting met Lyssavirus RNA en een negatief monster te bevestigen. Bovendien werd ß-actin, om de werkzaamheid van RNA-extractie te garanderen, samen met de test monsters in een aparte buis getest. Het Lyssavirus positieve controle RNA werd ook gebruikt voor de ß-actin positieve controle. Andere endogene genen of heterologeuze interne controlesystemen kunnen worden gebruikt. Het gebruik van deze besturingselementen zorgde ervoor dat alle stappen werden geanalyseerd onder dezelfde omstandigheden als de testsamples. Soms, als het monster sterk werd afgebroken of niet voldoende gastheer RNA bevat (zoals speeksel of CSF), kan de endogene genpcr mislukken. In dit geval, waar het Lyssavirus real-time RT-PCR-resultaat positief was, bevestiging op een onafhankelijke RNA-extractie-om besmetting te voorkomen tijdens RNA-extractie op de oorspronkelijke test of door een secundaire test (ofwel moleculaire, zoals conventionele RT-PCR) , of vet. Het gebruik van tabel 4 tijdens de analyse van een diagnostisch monster zorgde voor de juiste interpretatie.
Ongeacht de moleculaire assay die wordt gebruikt om een infectie met rabiës te bevestigen, follow-up onderzoeken met Sanger-sequencing om de soorten Lyssavirus te bepalen en klassieke technieken in virologie zoals vet of virusisolatie moeten ook worden ondernomen om het mogelijk te maken verdere virus karakterisering en ondersteuning van de melding van positieve gevallen aan OIE en WHO.

De diagnose van rabiës met behulp van moleculaire methodologieën werd door het OIE in 20181aanvaard, waarbij de voordelen van deze technieken voor de bevestiging van rabiës gevallen werden erkend, met name in situaties waarin de monsters suboptimaal zijn, of bij een antemortem-diagnose; omdat er geen behoefte is aan levend virus of verse monsters. PCR-testen voor lyssavirussen vereisen een omgekeerde transcriptie (RT) voordat PCR kan beginnen als het genoom RNA is. RT-PCR-testen die de 3 ' proximale regio van het genoom detecteren worden beschouwd als de meest gevoelige, als transcriptionele gradiënten optreden tijdens Lyssavirus replicatie. Veelgebruikte RT-PCR-testen kunnen globaal worden onderverdeeld in twee categorieën, eindpunt (of gel-gebaseerd) en real-time. Beide benaderingen zijn gevoelig en specifiek; de real-time assay heeft echter enkele extra voordelen, zoals het behalen van resultaten in ' real-time ' en het uitvoeren van een volledig gesloten buis systeem, waardoor de kans op besmetting van de machinist afneemt. Er zijn twee belangrijke benaderingen voor het detecteren van lyssavirusspecifieke amplicons verkregen met behulp van real-time testen. De eerste maakt gebruik van hydrolyse sondes (zoals taqman probes) die een de en een quencher bevatten. Wanneer de sonde tijdens de versterking aan de doelregio bindt, resulteert de exonuclease-activiteit van de polymerase in dissociatie van de en quencher, waardoor de resulterende fluorescentie kan worden gemeten. De tweede maakt gebruik van een DNA-intercalciërende kleurstof (fluorochrome zoals SYBR Green) die bindt aan dubbel gestrande DNA tijdens versterking. De gebonden fluorochromes zenden fluorescentie die wordt gedetecteerd bij elke cyclus, waardoor real-time detectie en kwantificering van het product. Vanwege de niet-specifieke aard van binding aan een dsDNA, wordt een dissociatie curve analyse ondernomen om de specificiteit van de reactie te bevestigen. Real-time RT-PCRs zijn snel als gevolg van de kleine ampliconlengte voor temp maten, meestal minder dan 200 BP in lengte; echter, het identificeren van geschikte regio's voor het ontwerpen van primers en sondes in geconmaveerde regio's, kan een uitdaging blijken, dus het verwijderen van de eis voor een sonde is een duidelijk voordeel.
Een aantal real-time RT-PCRs zijn ontworpen voor het specifiek opsporen van individuele stammen of lijn afstanden van rabv2 en ook voor het opsporen van lyssavirussen in het genus3,4,5,6, 7,8,9. Alle assays zullen een aantoonbaarheidsgrens hebben afhankelijk van hoe de primer (en indien nodig de sonde) sequenties over het genus worden bewaard. Inderdaad, opkomende of nieuwe virusstammen kunnen de zeer specifieke sonde gebaseerde assays ineffectief. De keuze van de real-time detectie (kleurstof versus sonde) is afhankelijk van de beoogde toepassing. Voor een laboratorium toezicht op lokaal geproduceerde hersen materiaal en verwachten van hoge aantallen negatieve monsters, het gebruik van de goedkopere intercalating kleurstof is een verstandige keuze. De SYBR groene aanpak zou ook optimaal zijn bij het uitvoeren van scanning surveillance waarbij de aanwezigheid van nieuwe of divergerende lyssavirussen onopgemerkt zou blijven door meer beperkte sonde-gebaseerde testen.
Alle leden van het geslacht Lyssavirus veroorzaken de ziekte rabiës, die is fataal zodra de symptomen verschijnen. De overgrote meerderheid van de gevallen van menselijke en dierlijke rabiës is te wijten aan het rabiësvirus (RABV), het dominante reservoir waarvoor de huis hond10is. Vleermuizen zijn belangrijke gastheer reservoirs voor lyssavirussen en alle maar twee Lyssavirus soorten gekenmerkt zijn direct geïdentificeerd in vleermuizen-Ikoma Lyssavirus (IKOV) en Mokola virus (MOKV)-en van deze twee, IKOV is gespeceeerd om een vleermuis gastheer reservoir 11. naast de 16 erkende Lyssavirus soorten12, er zijn twee lyssavirussen die onlangs zijn beschreven: Taiwan bat Lyssavirus (twblv)13 en kotalahti bat Lyssavirus (kblv)14. Lyssavirussen kunnen genetisch worden onderverdeeld in drie fylogroepen, met de meerderheid van lyssavirussen, waaronder RABV, behorend tot phylogroup I. Echter, de meest uiteenlopende lyssavirussen behoren tot phylogroup III en zijn waarschijnlijk niet worden gedetecteerd door RT-PCRs ontworpen om te richten op RABV of phylogroup I virus sequenties.
De hier beschreven assay maakt gebruik van de real-time primer pair JW12-N165, voor het eerst beschreven in 20053. De primers werden ontworpen om te worden pan-Lyssavirus hoewel de oorspronkelijke toepassing was als een TaqMan assay met sondes te differentiëren Lyssavirus soorten. Daaropvolgende bevestiging dat het primer paar was pan-Lyssavirus in specificiteit werd bereikt met behulp van een 2-stappen SYBR real-time assay op alle Lyssavirus soorten die beschikbaar zijn, waaronder WCBV15. Het primer paar wordt hier beschreven in een One-Step RT-PCR real-time assay met behulp van een intercalating fluorochrome, gevalideerd met behulp van vertegenwoordigers van alle 16 erkende Lyssavirus soorten. Deze real-time assay in één stap is een snelle, gevoelige, lyssavirusspecifieke assay en toont aan dat de robuustheid van de primer is ingesteld om zelfs zeer uiteenlopende Lyssavirus soorten te identificeren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Art Barrier pipette tips (various sizes)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra 21R</td>
			<td>Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (mico)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5150</td>
			<td>Equivalent kits can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P or MX3005P real-tme PCR system</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eqivalent machines can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp reaction plate base</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td>Used to hold tube strip and plates securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically clear flat clear strips (8)</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect fit frame (if using tube strips)</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Specific to machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: for primer details see Table 2.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered at 0.05 &#181;mole scale HPLC purified.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast 96 well plares, non skirted</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex machine / Whirlimixer</td>
			<td>Fisons Scientific equipment</td>
			<td>SGP-202-010J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unless stated, alternative equipment can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis

Moleculaire assays zijn snel, gevoelig en specifiek, en zijn centraal geworden bij het diagnosticeren van rabiës. PCR-gebaseerde assays zijn al decennia lang gebruikt om de diagnose van rabiës te bevestigen, maar zijn pas recentelijk geaccepteerd door de OIE (Wereldorganisatie voor diergezondheid) als een primaire methode om rabiës infectie op te sporen. Real-time RT-PCR-testen bieden real-time gegevens en zijn gesloten-buis systemen, waardoor het risico op verontreiniging tijdens de installatie wordt geminimaliseerd. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR-tests vereisen geen dure sondes, waardoor de kosten per monster worden geminimaliseerd en wanneer de primers zijn ontworpen in gecondengeerde regio's, die specifiek zijn voor virus geslachten in plaats van specifiek voor slechts één virus soorten zijn mogelijk. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus SYBR real-time RT-PCR-test die lyssavirussen in de Lyssavirus -genus detecteert, inclusief de meest uiteenlopende virussen ikov, WCBV en llebv. In combinatie met dissociatie curve analyse is deze assay gevoelig en specifiek, met als voordeel dat alle Lyssavirus soorten worden opgespoord. De test is goedgekeurd in vele diagnostische laboratoria met een gegarandeerde kwaliteit, waardoor een robuuste, snelle en gevoelige diagnose van dieren-en menselijke rabiës gevallen mogelijk is.

Watch this Scientific Journal Video about Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis at JoVE.com

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

Deze real-time RT-PCR met behulp van dsDNA intercalating Dye is geschikt om Lyssavirus infecties te diagnosticeren. De methode begint met RNA geëxtraheerd uit rabiës verdachte ante-mortem-of postmortemmonsters, detaillering Master Mix preparaat, RNA toevoeging, installatie van de real-time machine en juiste interpretatie van de resultaten.

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Deze real-time RT-PCR is geschikt om snel rabiës te diagnosticeren in ante-mortem- en postmortemmonsters. De Pan-Lyssavirus primers zijn geoptimaliseerd om alle leden van het Lyssavirus geslacht te identificeren. Dit is een snelle, gevoelige en gesloten buistest die virussen uit het hele geslacht Lyssavirus detecteert, waaronder zeer uiteenlopende soorten uit klinische specimens.Het OIE heeft onlangs aanvaard moleculaire tests om rabiës infectie te melden. Dit is vooral belangrijk voor ontbonden exemplaren die niet altijd kunnen worden gediagnosticeerd door viruscultuur of antigeendetectiemethoden. Vanwege de gevoeligheid van deze test is een goede laboratoriumpraktijk inclusief scheiding van de verschillende stadia van vitaal belang om het risico op besmetting te minimaliseren.Het aantonen van de procedure zal Daisy Jennings zijn, een diagnosticus uit mijn laboratorium. Begin met het kwantificeren van RNA met een micro volume spectrofotometer. Zorg ervoor dat de machine is ingesteld op RNA en gebruik een tot twee microliter moleculair water om de machine te normaliseren en een basislijn vast te stellen.Meet de RNA-concentratie en pas deze aan op één microgram per microliter. Plan de lay-out van uw PCR-plaat met een spreadsheet, rekening houdend met zowel test- als controlemonsters. Bereid een PCR-werkstation door oppervlakken te desinfecteren en schakel bij gebruik van een UV-kast het UV-licht 10 minuten voor het starten in.Verwijder reagentia en primers uit de vriezer om te ontdooien, maar houd het enzym mix op ijs te allen tijde. Meng de reagentia en centrifuge kort om de vloeistof te verzamelen. Bereid PCR master mixen voor Lyssavirus en Beta-Actin volgens het manuscript richtingen.Laat de meester mixen op ijs tot klaar voor gebruik. Meng en centrifugeer de bereide master mixen en doe 19 microliter af in de relevante putten van de PCR machine compatibele plaat of buisstrip. Voeg in een aparte ruimte of een UV-kast voorzichtig een microliter van het voorbereide RNA toe.Als u een UV-kast gebruikt, schakelt u het UV-licht 10 minuten voor aanvang in. Voeg na de testmonsters het positieve besturingselement en het besturingselement geen sjabloon toe. Bij het toevoegen van de RNA aan de master mixen, ervoor te zorgen dat het wordt toegevoegd aan de juiste put.Gebruik een plaat plan om deze stap te helpen. Verzegel de plaat door te controleren of de deksels plat over de plaat liggen en draai deze naar beneden om alle vloeistof aan de onderkant van de putten te verzamelen. Zorg ervoor dat elke put hetzelfde volume vloeistof heeft en dat er geen bellen zichtbaar zijn.Breng de monsters vervolgens over naar de PCR-machine. Open het programma door SYBR Green te kiezen met dissociatie. Selecteer de putten die moeten worden geanalyseerd door onbekend te kiezen als monstertype en SYBR als fluorescerende kleurstof.Label de putten op de plaat lay-out met de steekproef informatie met inbegrip van de vraag is voor Lyssavirus L of Beta-Actin. Klik op de thermoprofielopstelling en wijzig de thermische fietsomstandigheden zoals gespecificeerd in het manuscript. Klik op start en kies een locatie om het bestand op te slaan en schakel het selectievakje in om de lamp aan het einde van de run uit te schakelen.Wanneer de optie om te beginnen voordat de lamp warming-up verschijnt, klik nu lopen, maar zorg ervoor dat de lamp minder dan 15 minuten heeft om op te warmen. Wanneer de PCR-run is voltooid, gaat u verder met gegevensanalyse. Analyseer eerst de Lyssavirus versterkingspercelen.Positieve monsters tonen exponentiële hellingen, terwijl negatieve monsters platte versterkingspercelen hebben zonder CT-waarden. Analyseer vervolgens de lyssavirus dissociatiecurve resultaten van de testmonsters naast de controlemonsters. Een Lyssavirus positief monster zal een smelttemperatuur tussen 77 en 80 graden Celsius en overlappen met de positieve controle.Analyseer vervolgens de bèta-actin-versterkingsplots en dissociatiecurven die worden vergeleken met de besturingselementen om het algehele resultaat te interpreteren. Bekijk het tekstrapport en gebruik de details om de CT- en TM-waarden op te nemen die zijn verkregen voor het besturingselementRNA in een controlekaart om te bevestigen dat de run is geslaagd en dat de resultaten van het testmonster kunnen worden gerapporteerd. Dit protocol wordt gebruikt om de gevoeligheid van het Pan-Lyssavirus RT-PCR aan te tonen op een RNA verdunningsreeks van een controlestandaardvirus.De versterkingscurve geeft aan dat slechts 10 picogrammen van Lyssavirus kunnen worden gedetecteerd en de dissociatiecurven de smelttemperatuur van het product verifiëren. De smelttemperatuur wordt gebruikt om te bevestigen dat de amplicon lyssavirus specifiek is. De resultaten hier tonen een smeltende temperatuur bereik over het Lyssavirus geslacht van 77,34 tot 79,67 graden Celsius.Smelttemperatuurwaarden onder 76,8 of hoger dan 80,2 worden als niet-specifiek beschouwd. De gevoeligheid van deze RT-PCR test wordt ook bepaald door het detecteren van RNA van drie Lyssavirus positieve hersenmonsters. Slechts 0,1 picogrammen per microliter doelRNA kunnen worden gedetecteerd voor twee van de drie monsters.Met name vertegenwoordigers van alle erkende Lyssavirus soorten worden gedetecteerd met behulp van deze test. Als het analyseren van RNA-extracten uit klinische monsters zoals speeksel of CSF, Beta-Actin resultaten kunnen negatief zijn als gevolg van een gebrek aan gastheer nucleïnezuren. De toevoeging van een exogene controle kan dit probleem oplossen.Sequencing van Lyssavirus positieve monsters wordt aanbevolen om aanvullende informatie te verstrekken over de geografische en gastheer oorsprong van een rabiës infectie. De behandeling van lyssavirus positieve of vermoedelijke positieve monsters moet volgens de lokale richtlijnen voor gezondheid en veiligheid zijn. Het geëxtraheerde RNA is niet-infectieus en kan daarom worden behandeld in laboratoria met een lage insluiting.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Tools voor de real-time beoordeling van een Pseudomonas aeruginosa-infectiemodel

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...