Deze real-time RT-PCR is geschikt om snel rabiës te diagnosticeren in ante-mortem- en postmortemmonsters. De Pan-Lyssavirus primers zijn geoptimaliseerd om alle leden van het Lyssavirus geslacht te identificeren. Dit is een snelle, gevoelige en gesloten buistest die virussen uit het hele geslacht Lyssavirus detecteert, waaronder zeer uiteenlopende soorten uit klinische specimens.
Het OIE heeft onlangs aanvaard moleculaire tests om rabiës infectie te melden. Dit is vooral belangrijk voor ontbonden exemplaren die niet altijd kunnen worden gediagnosticeerd door viruscultuur of antigeendetectiemethoden. Vanwege de gevoeligheid van deze test is een goede laboratoriumpraktijk inclusief scheiding van de verschillende stadia van vitaal belang om het risico op besmetting te minimaliseren.
Het aantonen van de procedure zal Daisy Jennings zijn, een diagnosticus uit mijn laboratorium. Begin met het kwantificeren van RNA met een micro volume spectrofotometer. Zorg ervoor dat de machine is ingesteld op RNA en gebruik een tot twee microliter moleculair water om de machine te normaliseren en een basislijn vast te stellen.
Meet de RNA-concentratie en pas deze aan op één microgram per microliter. Plan de lay-out van uw PCR-plaat met een spreadsheet, rekening houdend met zowel test- als controlemonsters. Bereid een PCR-werkstation door oppervlakken te desinfecteren en schakel bij gebruik van een UV-kast het UV-licht 10 minuten voor het starten in.
Verwijder reagentia en primers uit de vriezer om te ontdooien, maar houd het enzym mix op ijs te allen tijde. Meng de reagentia en centrifuge kort om de vloeistof te verzamelen. Bereid PCR master mixen voor Lyssavirus en Beta-Actin volgens het manuscript richtingen.
Laat de meester mixen op ijs tot klaar voor gebruik. Meng en centrifugeer de bereide master mixen en doe 19 microliter af in de relevante putten van de PCR machine compatibele plaat of buisstrip. Voeg in een aparte ruimte of een UV-kast voorzichtig een microliter van het voorbereide RNA toe.
Als u een UV-kast gebruikt, schakelt u het UV-licht 10 minuten voor aanvang in. Voeg na de testmonsters het positieve besturingselement en het besturingselement geen sjabloon toe. Bij het toevoegen van de RNA aan de master mixen, ervoor te zorgen dat het wordt toegevoegd aan de juiste put.
Gebruik een plaat plan om deze stap te helpen. Verzegel de plaat door te controleren of de deksels plat over de plaat liggen en draai deze naar beneden om alle vloeistof aan de onderkant van de putten te verzamelen. Zorg ervoor dat elke put hetzelfde volume vloeistof heeft en dat er geen bellen zichtbaar zijn.
Breng de monsters vervolgens over naar de PCR-machine. Open het programma door SYBR Green te kiezen met dissociatie. Selecteer de putten die moeten worden geanalyseerd door onbekend te kiezen als monstertype en SYBR als fluorescerende kleurstof.
Label de putten op de plaat lay-out met de steekproef informatie met inbegrip van de vraag is voor Lyssavirus L of Beta-Actin. Klik op de thermoprofielopstelling en wijzig de thermische fietsomstandigheden zoals gespecificeerd in het manuscript. Klik op start en kies een locatie om het bestand op te slaan en schakel het selectievakje in om de lamp aan het einde van de run uit te schakelen.
Wanneer de optie om te beginnen voordat de lamp warming-up verschijnt, klik nu lopen, maar zorg ervoor dat de lamp minder dan 15 minuten heeft om op te warmen. Wanneer de PCR-run is voltooid, gaat u verder met gegevensanalyse. Analyseer eerst de Lyssavirus versterkingspercelen.
Positieve monsters tonen exponentiële hellingen, terwijl negatieve monsters platte versterkingspercelen hebben zonder CT-waarden. Analyseer vervolgens de lyssavirus dissociatiecurve resultaten van de testmonsters naast de controlemonsters. Een Lyssavirus positief monster zal een smelttemperatuur tussen 77 en 80 graden Celsius en overlappen met de positieve controle.
Analyseer vervolgens de bèta-actin-versterkingsplots en dissociatiecurven die worden vergeleken met de besturingselementen om het algehele resultaat te interpreteren. Bekijk het tekstrapport en gebruik de details om de CT- en TM-waarden op te nemen die zijn verkregen voor het besturingselementRNA in een controlekaart om te bevestigen dat de run is geslaagd en dat de resultaten van het testmonster kunnen worden gerapporteerd. Dit protocol wordt gebruikt om de gevoeligheid van het Pan-Lyssavirus RT-PCR aan te tonen op een RNA verdunningsreeks van een controlestandaardvirus.
De versterkingscurve geeft aan dat slechts 10 picogrammen van Lyssavirus kunnen worden gedetecteerd en de dissociatiecurven de smelttemperatuur van het product verifiëren. De smelttemperatuur wordt gebruikt om te bevestigen dat de amplicon lyssavirus specifiek is. De resultaten hier tonen een smeltende temperatuur bereik over het Lyssavirus geslacht van 77,34 tot 79,67 graden Celsius.
Smelttemperatuurwaarden onder 76,8 of hoger dan 80,2 worden als niet-specifiek beschouwd. De gevoeligheid van deze RT-PCR test wordt ook bepaald door het detecteren van RNA van drie Lyssavirus positieve hersenmonsters. Slechts 0,1 picogrammen per microliter doelRNA kunnen worden gedetecteerd voor twee van de drie monsters.
Met name vertegenwoordigers van alle erkende Lyssavirus soorten worden gedetecteerd met behulp van deze test. Als het analyseren van RNA-extracten uit klinische monsters zoals speeksel of CSF, Beta-Actin resultaten kunnen negatief zijn als gevolg van een gebrek aan gastheer nucleïnezuren. De toevoeging van een exogene controle kan dit probleem oplossen.
Sequencing van Lyssavirus positieve monsters wordt aanbevolen om aanvullende informatie te verstrekken over de geografische en gastheer oorsprong van een rabiës infectie. De behandeling van lyssavirus positieve of vermoedelijke positieve monsters moet volgens de lokale richtlijnen voor gezondheid en veiligheid zijn. Het geëxtraheerde RNA is niet-infectieus en kan daarom worden behandeld in laboratoria met een lage insluiting.
