이 실시간 RT-PCR은 앤테모템 및 사후 샘플에서 광견병을 신속하게 진단하는 데 적합합니다. 범 리사바이러스 프라이머는 Lyssavirus 속의 모든 구성원을 식별하도록 최적화되었습니다. 이것은 임상 견본에서 높게 발산종을 포함하여 Lyssavirus 속을 통해 바이러스를 검출하는 급속하고, 과민하고, 폐쇄한 관 분석입니다.
OIE는 최근에 광견병 감염을 보고하기 위하여 분자 적인 약서를 받아들였습니다. 이것은 항상 바이러스 배양 또는 항원 검출 방법에 의해 진단될 수 없는 분해된 견본을 위해 특히 중요합니다. 이 분석의 감도로 인해, 다른 단계의 분리를 포함한 좋은 실험실 관행은 오염의 위험을 최소화하기 위해 필수적이다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 진단받은 데이지 제닝스가 될 것입니다. 마이크로 볼륨 분광계로 RNA를 정량화하는 것으로 시작합니다. 기계가 RNA로 설정되어 있는지 확인하고 분자 등급 물의 1 ~ 2 마이크로 리터를 사용하여 기계를 정상화하고 기준선을 설정합니다.
RNA 농도를 측정하고 마이크로리터 당 1 마이크로그램으로 조정합니다. 테스트 및 제어 샘플을 모두 고려하여 스프레드시트를 사용하여 PCR 플레이트의 레이아웃을 계획합니다. 표면을 소독하여 PCR 워크스테이션을 준비하고 UV 캐비닛을 사용하는 경우 시작 10분 전에 UV 광을 켭니다.
냉동고에서 시약과 프라이머를 제거하여 해동하지만 효소 믹스를 항상 얼음에 보관하십시오. 시약과 원심분리기를 짧게 섞어 액체를 수집합니다. 원고 방향에 따라 Lyssavirus 및 베타 액틴에 대한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
마스터 믹스를 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 둡니다. 준비된 마스터 믹스를 혼합하고 원심분리하고 PCR 기계 호환 플레이트 또는 튜브 스트립의 관련 우물에 19 마이크로리터를 분배합니다. 별도의 방 이나 UV 캐비닛에, 신중 하 게 준비 된 RNA의 하나의 마이크로 리터를 추가.
UV 캐비닛을 사용하는 경우 시작 10분 전에 UV 광을 켭니다. 테스트 샘플 후 양수 컨트롤과 템플릿 컨트롤 없음을 추가합니다. 마스터 믹스에 RNA를 추가할 때 올바른 믹스에 RNA가 추가되었는지 확인합니다.
플레이트 계획을 사용하여 이 단계를 지원합니다. 뚜껑이 접시를 가로질러 평평하다는 것을 확인하는 판을 밀봉하고 우물 바닥에있는 모든 액체를 수집하기 위해 아래로 회전하십시오. 각 우물에 동일한 양의 액체가 있고 거품이 보이지 않도록 하십시오.
그런 다음 샘플을 PCR 기계로 옮킵니다. 해리와 SYBR 그린을 선택하는 프로그램을 엽니 다. 형광염으로 샘플 유형 및 SYBR로 알 수없는 선택으로 분석 할 우물을 선택합니다.
분석이 Lyssavirus L 또는 베타 액틴인지 여부를 포함하여 샘플 정보와 플레이트 레이아웃의 우물에 레이블을 지정합니다. 열 프로파일 설정을 클릭하고 원고에 명시된 대로 열 순환 조건을 수정합니다. 시작을 클릭한 다음 파일을 저장할 위치를 선택하고 실행 끝에 램프를 끄도록 확인합니다.
램프 워밍업 전에 시작하는 옵션이 나타나면 지금 실행하지만 램프가 15분 이내에 워밍업되도록 클릭합니다. PCR 실행이 완료되면 데이터 분석을 진행합니다. 먼저, Lyssavirus 증폭 플롯을 분석합니다.
양수 샘플은 지수 경사로를 표시하고 음수 샘플에는 CT 값이 없는 평평한 증폭 플롯이 있습니다. 다음으로, 제어 샘플과 함께 테스트 샘플의 Lyssavirus 해리 곡선 결과를 분석합니다. Lyssavirus 양성 샘플은 섭씨 77도에서 80도 사이의 용융 온도를 가지며 양수 제어와 겹칩니다.
다음으로, 전체 결과를 해석하기 위해 컨트롤과 비교하여 베타 액틴 증폭 플롯 및 해리 곡선을 분석합니다. 텍스트 보고서를 보고 컨트롤 카드에서 제어 RNA에 대해 얻은 CT 및 TM 값을 기록하기 위해 세부 정보를 사용하여 실행이 성공했으며 시험 샘플 결과를 보고할 수 있음을 확인합니다. 이 프로토콜은 제어 표준 바이러스의 RNA 희석 계열에 대한 범리사바이러스 RT-PCR의 민감도를 입증하는 데 사용된다.
증폭 곡선은 Lyssavirus의 10 picograms가 감지될 수 있고 해리 곡선이 제품의 용융 온도를 확인했음을 나타냅니다. 용융 온도는 앰플리슨이 리사바이러스 특정임을 확인하는 데 사용된다. 여기서 결과는 77.34에서 79.67섭의 Lysavirus 속을 가로질러 녹는 온도 범위를 보여줍니다.
76.8 이하 또는 80.2 이상의 용융 온도 값은 비특이적 인 것으로 간주됩니다. 이 RT-PCR 분석의 감도는 또한 3개의 Lysavirus 양성 두뇌 견본에서 RNA를 검출하여 결정됩니다. 표적 RNA의 마이크로리터 당 0.1 피코그램은 3개의 샘플 중 2개에 대해 검출될 수 있다.
특히, 모든 인식 된 Lyssavirus 종의 대표는이 분석서를 사용하여 검출됩니다. 타액 또는 CSF와 같은 임상 샘플에서 RNA 추출물을 분석하는 경우, 베타-액틴 결과는 숙주 핵산의 부족으로 인해 부정적일 수 있다. 외인성 제어의 추가는 이 문제를 해결할 수 있다.
Lyssavirus 양성 샘플의 시퀀싱은 광견병 감염의 지리적 및 호스트 기원에 관한 추가 정보를 제공하는 것이 좋습니다. Lyssavirus 양성 또는 의심되는 양성 샘플의 처리는 지역 보건 및 안전 지침에 따라 이루어져야 합니다. 추출된 RNA는 비전염성, 따라서 낮은 봉쇄 실험실 내에서 취급될 수 있다.
