Denne sanntid RT-PCR er egnet til raskt å diagnostisere rabies i ante-mortem og post-mortem prøver. Pan-Lyssavirus primere er optimalisert for å identifisere alle medlemmer av Lyssavirus slekten. Dette er en rask, følsom og lukket røranalyse som oppdager virus fra hele Lyssavirus-slekten, inkludert svært divergerende arter fra kliniske prøver.
OIE har nylig akseptert molekylære analyser for å rapportere rabiesinfeksjon. Dette er spesielt viktig for nedbrutte prøver som ikke alltid kan diagnostiseres av viruskultur eller antigendeteksjonsmetoder. På grunn av følsomheten til denne analysen er god laboratoriepraksis, inkludert separasjon av de ulike stadiene, avgjørende for å minimere risikoen for forurensning.
Å demonstrere prosedyren vil være Daisy Jennings, en diagnostikk fra laboratoriet mitt. Start med å kvantifisere RNA med et mikrovolumspektrofotometer. Sørg for at maskinen er satt til RNA og bruk ett til to mikroliter molekylært vann for å normalisere maskinen og etablere en grunnlinje.
Mål RNA-konsentrasjonen og juster den til ett mikrogram per mikroliter. Planlegg oppsettet av PCR-platen med et regneark som tar hensyn til både test- og kontrolleksempler. Forbered en PCR-arbeidsstasjon ved å desinfisere overflater, og hvis du bruker et UV-skap, slår du på UV-lyset 10 minutter før start.
Fjern reagenser og primere fra fryseren for å tine, men hold enzymblandingen på is til enhver tid. Bland reagensene og sentrifuge kort for å samle væsken. Forbered PCR master mikser for Lyssavirus og Beta-Actin i henhold til manuskriptet retninger.
La masterblandingene være på is til den er klar til bruk. Bland og sentrifuger de tilberedte masterblandingene og dispenser 19 mikroliter inn i de relevante brønnene til PCR-maskinkompatibel plate eller rørstripe. I et eget rom eller et UV-skap, legg forsiktig til en mikroliter av den tilberedte RNA.
Hvis du bruker et UV-skap, slår du på UV-lyset 10 minutter før start. Etter testeksemplene legger du til den positive kontrollen og ingen malkontroll. Når du legger til RNA i hovedblandingene, må du sørge for at den legges til riktig brønn.
Bruk en plateplan for å hjelpe dette trinnet. Forsegle platen som kontrollerer at lokkene er flate over platen og spinner den ned for å samle all væske på bunnen av brønnene. Sørg for at hver brønn har samme volum væske og ingen bobler er synlige.
Deretter overfører du prøvene til PCR-maskinen. Åpne programmet velge SYBR Green med dissosiasjon. Velg brønnene som skal analyseres velge ukjent som prøvetype og SYBR som fluorescerende fargestoff.
Merk brønnene på plateoppsettet med prøveinformasjonen, inkludert om analysen er for Lyssavirus L eller Beta-Actin. Klikk på termoprofiloppsett og endre de termiske sykkelforholdene som spesifisert i manuskriptet. Klikk start og velg deretter en plassering for å lagre filen, og merk av i boksen for å slå av lampen på slutten av løpet.
Når alternativet for å starte før lampeoppvarming vises, klikker du kjør nå, men kontroller at lampen har mindre enn 15 minutter å varme opp. Når PCR-kjøringen er fullført, fortsetter du med dataanalyse. Først analysere Lyssavirus forsterkning tomter.
Positive prøver viser eksponentielle ramper mens negative prøver har flate forsterkningsplott uten CT-verdier. Deretter analyserer du lyssavirusdissosiasjonskurveresultatene av testprøvene sammen med kontrollprøvene. En Lyssavirus positiv prøve vil ha en smeltetemperatur mellom 77 og 80 grader Celsius og overlappe med den positive kontrollen.
Deretter analyserer du Beta-Actin-forsterkningsplottene og dissosiasjonskurvene som sammenligner med kontrollene for å tolke det totale resultatet. Vis tekstrapporten, og bruk detaljene til å registrere CT- og TM-verdiene som er hentet for kontroll-RNA på et kontrollkort for å bekrefte at kjøringen var vellykket, og at testeksempelresultatene kan rapporteres. Denne protokollen brukes til å demonstrere følsomheten til Pan-Lyssavirus RT-PCR på en RNA-fortynningsserie av et kontrollstandardvirus.
Forsterkningskurven indikerer at så lite som 10 picogrammer av Lyssavirus kan oppdages og dissosiasjonskurvene verifiserer smeltetemperaturen til produktet. Smeltetemperaturen brukes til å bekrefte at amplicon er Lyssavirus spesifikk. Resultatene her viser et smeltetemperaturområde over Lyssavirus-slekten på 77,34 til 79,67 grader Celsius.
Smeltetemperaturverdier under 76,8 eller over 80,2 anses som ikke-spesifikke. Følsomheten til denne RT-PCR-analysen bestemmes også ved å oppdage RNA fra tre Lyssaviruspositive hjerneprøver. Så lite som 0,1 picograms per mikroliter av mål RNA kan oppdages for to av de tre prøvene.
Spesielt oppdages representanter fra alle anerkjente Lyssavirus-arter ved hjelp av denne analysen. Hvis analyse av RNA-ekstrakter fra kliniske prøver som spytt eller CSF, kan Beta-Actin-resultatene være negative på grunn av mangel på vertskjernesyrer. Tillegg av en eksogen kontroll kan løse dette problemet.
Sekvensering av Lyssavirus positive prøver anbefales å gi ytterligere informasjon om geografisk og vert opprinnelse av en rabies infeksjon. Håndtering av Lyssaviruspositive eller mistenkte positive prøver må være i henhold til lokale retningslinjer for helse og sikkerhet. Den ekstraherte RNA er ikke-smittsom, derfor kan håndteres innenfor lav inneslutningslaboratorier.
