Este RT-PCR en tiempo real es adecuado para diagnosticar rápidamente la rabia en muestras ante mortem y post mortem. Las imprimaciones Pan-Lyssavirus han sido optimizadas para identificar a todos los miembros del género Lyssavirus. Este es un ensayo rápido, sensible y de tubo cerrado que detecta virus de todo el género Lyssavirus, incluyendo especies altamente divergentes de especímenes clínicos.
La OIE ha aceptado recientemente ensayos moleculares para denunciar la infección por rabia. Esto es particularmente importante para los especímenes descompuestos que no siempre pueden ser diagnosticados por el cultivo del virus o los métodos de detección de antígenos. Debido a la sensibilidad de este ensayo, una buena práctica de laboratorio, incluida la separación de las diferentes etapas, es vital para minimizar el riesgo de contaminación.
Demostrando el procedimiento estará Daisy Jennings, una diagnóstica de mi laboratorio. Comience cuantificando el ARN con un espectrofotómetro de micro volumen. Asegúrese de que la máquina esté ajustada al ARN y utilice una o dos microlitros de agua de grado molecular para normalizar la máquina y establecer una línea de base.
Mida la concentración de ARN y ajústela a un microgramo por microlitro. Planifique el diseño de su placa PCR con una hoja de cálculo teniendo en cuenta tanto las muestras de prueba como las de control. Prepare una estación de trabajo PCR desinfectando superficies y, si utiliza un gabinete UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de arrancar.
Retire los reactivos y las imprimaciones del congelador para descongelar pero mantenga la mezcla enzimática sobre hielo en todo momento. Mezclar brevemente los reactivos y la centrífuga para recoger el líquido. Preparar mezclas maestras de PCR para Lyssavirus y Beta-Actin de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Deje las mezclas maestras sobre hielo hasta que estén listas para usar. Mezclar y centrifugar las mezclas maestras preparadas y dispensar 19 microlitros en los pozos pertinentes de la placa o tira de tubo compatible con la máquina PCR. En una habitación separada o en un armario UV, agregue cuidadosamente un microlitro del ARN preparado.
Si utiliza un armario UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de arrancar. Después de las muestras de prueba, agregue el control positivo y el control sin plantilla. Al agregar el ARN a las mezclas maestras, asegúrese de que se agrega al pozo correcto.
Utilice un plan de placas para ayudar a este paso. Selle la placa comprobando que las tapas están planas a través de la placa y gírala hacia abajo para recoger todo el líquido en la parte inferior de los pozos. Asegúrese de que cada pozo tenga el mismo volumen de líquido y que no haya burbujas visibles.
A continuación, transfiera las muestras a la máquina PCR. Abra el programa eligiendo SYBR Green con disociación. Seleccione los pozos a analizar eligiendo desconocido como el tipo de muestra y SYBR como el tinte fluorescente.
Etiquete los pozos en el diseño de la placa con la información de la muestra, incluyendo si el ensayo es para Lyssavirus L o Beta-Actin. Haga clic en la configuración del perfil térmico y modifique las condiciones de ciclo térmico especificadas en el manuscrito. Haga clic en Inicio y, a continuación, elija una ubicación para guardar el archivo y marque la casilla para apagar la lámpara al final de la ejecución.
Cuando aparezca la opción de iniciar antes de calentar la lámpara, haga clic en Ejecutar ahora, pero asegúrese de que la lámpara tenga menos de 15 minutos para calentarse. Cuando se haya completado la ejecución del PCR, proceda con el análisis de datos. Primero, analice las gráficas de amplificación de Lyssavirus.
Las muestras positivas muestran rampas exponenciales, mientras que las muestras negativas tienen gráficas de amplificación planas sin valores de TC. A continuación, analice los resultados de la curva de disociación de Lyssavirus de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Una muestra positiva de Lyssavirus tendrá una temperatura de fusión entre 77 y 80 grados Celsius y se solapará con el control positivo.
A continuación, analice las gráficas de amplificación beta-actina y las curvas de disociación en comparación con los controles para interpretar el resultado general. Vea el informe de texto y utilice los detalles para registrar los valores CT y TM obtenidos para el ARN de control en una tarjeta de control para confirmar que la ejecución se realizó correctamente y que se pueden notificar los resultados de la muestra de prueba. Este protocolo se utiliza para demostrar la sensibilidad del Pan-Lyssavirus RT-PCR en una serie de dilución de ARN de un virus estándar de control.
La curva de amplificación indica que se pueden detectar tan solo 10 picogramos de Lyssavirus y las curvas de disociación verifican la temperatura de fusión del producto. La temperatura de fusión se utiliza para confirmar que el amplicon es específico del lyssavirus. Los resultados aquí muestran un rango de temperatura de fusión en todo el género Lyssavirus de 77.34 a 79.67 grados Celsius.
Los valores de temperatura de fusión inferiores a 76,8 o superiores a 80,2 se consideran no específicos. La sensibilidad de este ensayo RT-PCR también se determina mediante la detección de ARN a partir de tres muestras cerebrales positivas de Lyssavirus. Se pueden detectar tan solo 0,1 picogramos por microlitro de ARN objetivo para dos de las tres muestras.
En particular, los representantes de todas las especies reconocidas de Lyssavirus se detectan utilizando este ensayo. Si se analizan extractos de ARN a partir de muestras clínicas como saliva o CSF, los resultados de Beta-Actin pueden ser negativos debido a la falta de ácidos nucleicos del huésped. La adición de un control exógeno puede resolver este problema.
Se recomienda la secuenciación de muestras positivas de Lyssavirus para proporcionar información adicional sobre los orígenes geográficos y del huésped de una infección por rabia. La manipulación de muestras positivas de Lyssavirus o sospechas positivas debe ser de acuerdo con las pautas locales de salud y seguridad. El ARN extraído no es infeccioso, por lo tanto se puede manejar dentro de laboratorios de baja contención.
