Name: pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis at JoVE.com

Los autores desean agradecer a la señorita Emma Wise y a la señorita Megan Golding por su ayuda para completar los experimentos. El desarrollo de este protocolo contó con el apoyo financiero del Departamento de Medio Ambiente, Alimentación y Asuntos Rurales del Reino Unido (Defra), el Gobierno escocés y el Gobierno galés mediante subvenciones [SV3500 y SE0431] y por el proyecto European Virus Archive global (EVAg) que ha recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 653316.

Muestras de material de diagnóstico recibidas en APHA después de una infección natural, u obtenidas inoculando ratones utilizando protocolos evaluados por el comité de ética y estadística de APHA bajo las regulaciones del Home Office del Reino Unido bajo licencia 70/7394.
1. Cuantificación del ARN mediante un espectrofotómetro de microvolúmenes
<ol><li>Asegúrese de que los ajustes del espectrofotómetro estén ajustados a ARN.</li>
	<li>Utilice 1-2 l de agua de grado molecular para inicializar la máquina y establecer una línea de base.</li>
	<li>Utilice 1-2 l de cada muestra de ARN de prueba para evaluar la cantidad de ARN.</li>
	<li>Guarde las lecturas y el documento.</li>
	<li>Ajuste el ARN a 1 g/L, si es necesario. NOTA: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento. Si se obtiene ARN utilizando una columna, o método basado en perlas, el ARN suele ser inferior a 1 g/L. En esta situación utilice el ARN limpio.</li>
</ol>2. Preparación de la serie de dilución de ARN para determinar la sensibilidad del punto final
<ol><li>
Haga una dilución serial de 10 veces del ARN.
	<ol>
<li>Etiquetar tubos con la serie de dilución (por ejemplo, 10-1, 10-2, etc.) y los detalles del ARN.</li>
		<li>Añadir 45 l de agua de grado molecular a cada tubo.</li>
		<li>Añadir 5 l de ARN (previamente diluido a 1 g/L) y mezclar bien.</li>
		<li>Deseche la punta de la pipeta en el desinfectante adecuado y reemplácelo con una punta nueva.</li>
		<li>Tomar 5 l de la 10-1 y añadir a 10-2 tubo y mezclar bien.</li>
		<li>Repita 2.1.3-2.1.5 con las diluciones restantes. NOTA: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de reacciones RT-PCR en tiempo real
<ol><li>Usando una hoja de cálculo, planifique el diseño de la placa de acuerdo con el número de muestras de prueba y muestras de control, tanto para el lissavirus como para los ensayos de actina. NOTA: Si se van a probar 4 muestras por duplicado con un control positivo y negativo, esto equivale a 10 reacciones para ambos ensayos.</li>
	<li>En una "sala limpia" o área separada de la plantilla de ARN, limpie las superficies con un desinfectante adecuado antes de usar o prepare una estación de trabajo PCR (si lo utiliza). Para preparar la estación de trabajo, limpie la superficie del gabinete con un desinfecto adecuado y coloque los elementos necesarios en la estación de trabajo y cierre las puertas. Encienda la luz UV durante 10 minutos</li>
	<li>Retire los regentes y las imprimaciones del congelador y el deshielo (reactivos enumerados en la Tabla 1 y los imprimadores de la Tabla2). NOTA: La mezcla enzimática se almacena en glicerol por lo que no requiere descongelación y debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento. Todos los demás reactivos se pueden descongelar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una vez descongelado, mezcle los reactivos y la centrífuga brevemente para recoger líquido. NOTA: No vórtice la mezcla enzimática, sólo centrifugar brevemente.</li>
	<li>Preparar mezclas maestras separadas para el lissavirus y la actina. Para cada reacción, añadir 7,55 ml de agua de grado molecular, 10 l de 2 x mezcla de reacción verde SYBR universal, 0,6 l de imprimación directa, 0,6 l de imprimación inversa, 0,25 l de mezcla enzimática iTaq RT.
	<ol>
<li>Utilice una hoja de cálculo para calcular los volúmenes correctos para evitar errores en el cálculo manual. Asegúrese de que se haya preparado suficiente mezcla maestra para compensar el error de pipeteo. Por lo tanto, si se requieren 10 reacciones (ver NOTA en 3.1), prepare 12 reacciones</li>
		<li>Preparar la mezcla maestra en hielo (o en un bloque fresco) y permanecer en hielo hasta que se coloque en la máquina en tiempo real.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezcle las mezclas maestras preparadas, centrifugar brevemente y dispensar 19 ol en los pozos relevantes de tubos de tiras o una placa de 96 pocillos compatible con la máquina en tiempo real en uso. NOTA: Minimizar la producción de burbujas en los pozos mientras se pipetea.</li>
	<li>En una habitación separada, o en un armario UV preparado como se describe en 3.2, agregue cuidadosamente 1 l del ARN previamente ajustado a 1 g/l (ver paso 1.5) debajo de la superficie del pozo maestro-mezcla apropiado y mezcle suavemente. Deseche la punta de la pipeta en el desinfectante directamente después de su uso (bajo la superficie).
	<ol>
<li>Agregue los controles después de las muestras de prueba, con el control positivo añadido siguiente y el control sin plantilla (NTC – agua de grado molecular) añadido en último lugar. La cantidad de ARN utilizada puede ser alterada dependiendo del tipo de muestra, y la extracción de ARN utilizada. La cantidad utilizada debe validarse para garantizar que la reacción esté optimizada.</li>
	</ol></li>
	<li>Sellar la placa con tapas de tiras o sellador teniendo cuidado de asegurar que todas las tapas estén firmemente cerradas y etiquetadas lo suficiente como para orientar las muestras. Etiquete el borde de los tubos de placa/tira.</li>
	<li>Gire las muestras usando una centrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior de los pozos.</li>
	<li>Transfiera la placa a la máquina PCR en tiempo real, abra la puerta y colóquela en el soporte asegurando la ubicación/orientación correcta de las muestras de acuerdo con el diseño de la placa. NOTA: Si se utilizan tiras de tubo, asegúrese de que el soporte esté en su lugar.</li>
	<li>Abra el programa de máquina PCR en tiempo real y elija la opción para el experimento en tiempo real SYBR con la curva de disociación. Programe la máquina PCR en tiempo real utilizando las condiciones de ciclo térmico especificadas en la Tabla3, incluidos los puntos de recopilación de datos.</li>
	<li>Seleccione SYBR como el colorante fluorescente y seleccione unknown como el tipo de muestra e inserte un nombre en el cuadro de nombre de muestra correcto. NOTA: Diferenciar entre las réplicas y también entre los pozos de lissavirus y de la actina.</li>
	<li>Elija una ubicación de archivo para guardar los datos experimentales, asegúrese de que la lámpara se apagará al final de la ejecución y, a continuación, inicie la ejecución. NOTA: Como el primer paso es una etapa RT, no se recopilan datos durante este tiempo, por lo tanto, si la lámpara requiere un período de calentamiento, esto puede ocurrir durante la etapa RT. La máquina y el software en tiempo real mostrarán las curvas de amplificación en tiempo real, mientras que la curva de fusión se generará al final del ciclo.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>
Una vez completada la ejecución, realice el análisis de datos de la siguiente manera.
	<ol>
<li>En primer lugar, analice los resultados de la gráfica de amplificación de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Las muestras positivas muestran rampas exponenciales, generalmente seguidas de meseta y un valor C t. Las muestras negativas muestran gráficas de amplificación planas sin valores Ct (Figura1A). El valor Ct es calculado automáticamente por el software, aunque esto debe ser comprobado y alterado manualmente si es necesario.</li>
		<li>En segundo lugar, analice los resultados de la curva de disociación de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Una muestra positiva tendrá una temperatura de fusión (Tm) 77 – 80 oC, y se solapará con la Figura de control positivo 1B).</li>
		<li>Obtenga el resultado de diagnóstico general asegurándose de que los controles son válidos. Utilice la Tabla 4 para interpretar los resultados en relación con el control interno de la acción. Si las muestras de control positivas son negativas y/o las muestras negativas son positivas, la ejecución debe no tenerse en cuenta.</li>
		<li>Registre los valores Ct y Tm obtenidos para el ARN de control en una "tarjeta de control" para permitir el análisis de tendencias y ayudar a identificar derivas en la sensibilidad del ensayo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE.">OIE.</a> OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).</li><li>Panning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+rabies+virus+reverse+transcription-PCR+and+virus+isolation+using+samples+from+a+patient+infected+with+rabies+virus.">Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).</li><li>Wakeley, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time,+TaqMan+reverse+transcription-PCR+assay+for+detection+and+differentiation+of+lyssavirus+genotypes+1,+5,+and+6.">Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SYBR-green+I+quantitative+real-time+reverse+transcription-PCR+assay+for+rabies+viruses+with+different+virulence.">A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence.</a> Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).</li><li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+Assay+for+the+Detection+of+Highly+Variable+Rabies+virus+and+Other+Lyssaviruses.">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).</li><li>Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+real-time+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+methods+for+human+rabies+diagnosis.">Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).</li><li>Hoffmann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+safety+for+molecular+diagnosis+of+classical+rabies+viruses+by+use+of+a+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+&#34;double+check&#34;+strategy.">Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR &#34;double check&#34; strategy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).</li><li>Faye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+sensitive+real-time+RT-PCR+assay+for+broad+detection+of+rabies+virus.">Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus.</a> Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).</li><li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Combined+Real-Time+Reverse+Transcription+Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+the+Diagnosis+of+Lyssavirus+Infection.">Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>Marston, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ikoma+lyssavirus,+highly+divergent+novel+lyssavirus+in+an+african+civet.">Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet.</a> Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).</li><li>. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33) Available from: <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy/">https://talk.ictvonline.org/taxonomy/</a> (2018)</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hayman, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses.">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li><li>Calisher, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+relationships+among+rhabdoviruses+from+vertebrates+and+hematophagous+arthropods.">Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods.</a> Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).</li><li>Aznar-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rhabdovirus+viral+RNA+in+oropharyngeal+swabs+and+ectoparasites+of+Spanish+bats.">Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats.</a> Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo RT-PCR en tiempo real de pan-lyssavirus descrito es un ensayo de tubo cerrado de un solo paso que detecta lissavirus en los tres filogrupos. El ensayo ha sido validado para el diagnóstico de rabia animal y humana, incluyendo tejido cerebral post mortem (óptimo tronco encefálico), y muestras ante mortem como biopsia de piel, saliva recogida en serie o líquido cefalorraquídeo (LIF). Los imprimadores utilizados en este ensayo se diseñaron y utilizaron por primera vez para un ensayo basadoen sondas para diferenciar entre RABV, EBLV-1 y EBLV-2 3, que se ha utilizado en muchos laboratorios de rabia de la OIE y se desempeña constantemente en los esquemas de competencia EURL. Posteriormente, la naturaleza del «pan-lyssavirus» de estos imprimadores se ha confirmado utilizando un ensayo en tiempo real de 2 pasos15. El ensayo descrito aquí ha utilizado las imprimaciones para optimizar aún más el RT-PCR en un ensayo SYBR de un solo paso que permite un sistema rápido de tubo cerrado. Además, la formación en países endémicos de la rabia utilizando este ensayo ha confirmado la idoneidad para implementar en cualquier laboratorio con EPI básico y sistemas de calidad para reducir la contaminación cruzada y rastrear muestras, instalaciones para almacenar los reactivos y un máquina con detección SYBR. El ensayo es extremadamente robusto y tiene una correlación del 100% con el FAT, con una sensibilidad mejorada para muestras descompuestas3. Una de las principales ventajas de un ensayo basado en tinte intercalado de ADN en comparación con un ensayo basado en sondas es el costo relativo. Un beneficio adicional es que el ensayo sólo utiliza dos imprimaciones, por lo tanto hay menos riesgo de detección fallida debido a la divergencia de secuencia, que ha sido una debilidad en los ensayos basados en sondas publicados anteriormente. De hecho, los representantes de todas las especies de lissavirus (aparte de TWBLV y KBLV) se detectan utilizando este ensayo, y el análisis de secuencia de TWBLV y KBLV en los sitios de imprimación no revela ninguna divergencia significativa que sugiera fuertemente que también se detectarán utilizando este método. El rango de límite de detección observado a través de los virus analizados, se puede considerar que se debe a dos factores principales. La primera es que el ARN se aisló del material clínico del cerebro, por lo tanto, la cantidad de copias del genoma en cada muestra sin diluir no es directamente comparable. El ARN se 'normalizó' ajustando el ARN total a 1 g/L; sin embargo, la proporción de ARN del genoma viral dentro de esa muestra variará. La segunda es la diversidad de secuencias de lissavirus, a pesar de que los sitios de primer lugar se encuentran en regiones conservadas, siguen existiendo posiciones de variación. Por lo tanto, no es de extrañar que la mayoría de los lissavirus con menor sensibilidad para el ensayo sean virus del filogrupo II y III. El análisis de la curva de disociación representa un parámetro esencial, minimizando un resultado falso positivo que de otro modo podría ocurrir debido a la formación de atenuadores de imprimación, o la amplificación de una región no específica en el genoma del huésped. En realidad, esto es una ocurrencia rara y el análisis de la curva de disociación es equivalente a ejecutar un gel de agarosa para visualizar los amplicons RT-PCR convencionales de tamaño correcto. Se ha proporcionado la gama de valores Tm aceptables (77-80 oC), sobre la base de los datos recogidos en nuestro laboratorio. Se recomienda encarecidamente que los laboratorios individuales cotezcan los datos internos para garantizar que el rango sea transferible y modifique en consecuencia. La interpretación de los resultados de las gráficas de amplificación y disociación, junto con los controles positivos y negativos y los resultados de la acción, permite resultados diagnósticos robustos y reproducibles.
Fuera del ámbito de aplicación de este protocolo está el método de extracción de ARN utilizado para obtener ARN de alta calidad. Todo el ARN analizado en este protocolo se preparó utilizando TRIzol; sin embargo, hay muchos protocolos adecuados de extracción de ARN basados en guanidio disponibles, incluyendo kits de extracción basados en columnas y cuentas. La manipulación de muestras positivas (o sospechosas positivas) de lissavirus debe estar dentro de las instalaciones de biocontención autorizadas aprobadas dentro del país. Sin embargo, el ARN total extraído no es infeccioso, por lo tanto manejado dentro de laboratorios de baja contención. Dependiendo del método de extracción utilizado, el requisito de cuantificar y diluir el ARN tendría que evaluarse. Para extracciones a base de fenol, incluyendo TRIzol, este paso es necesario y evita que la inhibición del ensayo de contaminar gDNA; sin embargo, las extracciones a base de columnas y cuentas (particularmente aquellas con una etapa de agotamiento del ADN) no requieren dilución antes de la prueba.
A lo largo del protocolo, es esencial que el cuidado y la diligencia se utilicen para evitar la contaminación cruzada y la adición precisa de la muestra a los pozos correctos. Una hoja de cálculo con los cálculos de reactivos y el diseño de placas está disponible para su descarga como un archivo suplementario. Las buenas prácticas de laboratorio, incluyendo superficies de trabajo limpias, cambios regulares de guantes, uso de puntas de barrera y diferentes habitaciones / gabinetes UV para separar cada etapa minimizará la posibilidad de contaminación. Para garantizar que la prueba funciona con los parámetros esperados, se deben incluir controles positivos y negativos y todas las muestras de prueba se ejecutan por duplicado (o triplicado).
La inclusión de controles es una característica esencial de cualquier PCR, especialmente para el diagnóstico. El ARN de control positivo se preparó a partir de cerebros de ratón infectados por CVS (estándar de virus de desafío) en lotes y validado y calibrado para garantizar la coherencia entre lotes. El ARN de control se cuantificó y diluyó a 1 g/L. de ARN para el que se obtuvo un resultado positivo en una dilución en serie de al menos 10-4 (igual a 100 pg/L) se consideró adecuado para su propósito. El ARN de control positivo se almacenó a -80 oC en 10-1 alícuotas. Cuando fue necesario, se diluyó una alícuota 1:100 para proporcionar una culata de trabajo a 1 ng/L y se almacenó a -80 oC en alícuotas de un solo uso de 5 ml. El ARN de control positivo diluido se utilizó para representar muestras positivas de bajo nivel y para garantizar que se detectara cualquier reducción de la sensibilidad del ensayo. Se mantuvo una "tarjeta de control" para cada control para supervisar los valores Ct e identificar tendencias (Tabla 5). La Tabla 5 demostró una buena comparabilidad entre las funciones de los valores de la muestra de control positivo CVS Ct y Tm a lo largo de varios días y operadores, lo que brinda seguridad de que el ensayo es robusto y reproducible. Los resultados que se desvíen de estas mediciones deben investigarse y repetirse muestras si es necesario. El agua de grado molecular se incluyó en cada carrera como un NTC para confirmar que los reactivos estaban libres de contaminación con ARN de lissavirus y confirmar una muestra negativa. Además, para garantizar la eficacia de la extracción de ARN, se probó la acción junto con las muestras de ensayo en un tubo separado. El ARN de control positivo de lyssavirus también se utilizó para el control positivo de la actina. Se pueden utilizar otros genes endógenos o sistemas de control interno heterologoso. El uso de estos controles garantizaba que todos los pasos se analizaran en las mismas condiciones que las muestras de prueba. Ocasionalmente, si la muestra estaba muy degradada o no contenía suficiente ARN huésped (como saliva o LCP), el gen endógeno PCR puede fallar. En este caso, donde el resultado de RT-PCR en tiempo real de lyssavirus fue positivo, la confirmación de una extracción independiente de ARN - para descartar la contaminación durante la extracción de ARN en la prueba original o por una prueba secundaria (ya sea molecular, como RT-PCR convencional) , o FAT. El uso de la Tabla 4 durante el análisis de una muestra diagnóstica aseguró la interpretación correcta.
Independientemente del ensayo molecular utilizado para confirmar la infección por rabia, también deben realizarse investigaciones de seguimiento utilizando la secuenciación de Sanger para determinar las especies de lissavirus y las técnicas clásicas en virología como el FAT o el aislamiento de virus para mayor caracterización del virus y apoyar la notificación de casos positivos a la OIE y a la OMS.

El diagnóstico de la rabia utilizando metodologías moleculares fue aceptado por la OIE en 20181, reconociendo las ventajas de estas técnicas en la confirmación de casos de rabia, particularmente en situaciones en las que las muestras son subóptimas, o para el diagnóstico ante mortem, ya que no hay ningún requisito para virus vivos o muestras frescas. Los ensayos de PCR para lissavirus requieren una transcripción inversa (RT) antes de que la PCR pueda comenzar ya que el genoma es ARN. Los ensayos RT-PCR que detectan la región proximal de 3' del genoma se consideran los más sensibles, ya que los gradientes de transcripción se producen durante la replicación del lissavirus. Los ensayos RT-PCR de uso común se pueden dividir ampliamente en dos categorías, punto final (o basado en gel) y en tiempo real. Ambos enfoques son sensibles y específicos; sin embargo, el ensayo en tiempo real tiene algunos beneficios adicionales, como obtener resultados en "tiempo real" y realizarse en un sistema de tubos completamente cerrado, reduciendo así el potencial de contaminación del operador. Existen dos enfoques principales para detectar amplicons específicos del lissavirus obtenidos mediante ensayos en tiempo real. La primera utiliza sondas de hidrólisis (como sondas TaqMan) que contienen un fluoróforo y un quencher. Cuando la sonda se une a la región objetivo durante la amplificación, la actividad de exonucleasa de la polimerasa da lugar a la disociación del fluoróforo y el quencher, lo que permite medir la fluorescencia resultante. El segundo utiliza un tinte intercalante de ADN (fluorocromo como SYBR Green) que se une al ADN de doble cadena durante la amplificación. Los fluorocromos enlazados emiten fluorescencia que se detecta en cada ciclo, permitiendo la detección y cuantificación en tiempo real del producto. Debido a la naturaleza no específica de la unión a cualquier dsDNA, se lleva a cabo un análisis de la curva de disociación para confirmar la especificidad de la reacción. Los RT-PCR en tiempo real son rápidos debido a los pequeños tamaños de amplificación, típicamente menos de 200 bp de longitud; sin embargo, identificar regiones adecuadas para diseñar imprimaciones y sondas en regiones conservadas, puede resultar difícil, por lo que eliminar el requisito de una sonda es una ventaja distinta.
Se han diseñado varios RT-PCR en tiempo real para detectar específicamente cepas o linajes individuales de RABV2 y también para detectar lissavirus en todo el género3,4,5,6, 7,8,9. Todos los ensayos tendrán un límite de detección dependiendo de la conservación de las secuencias de imprimación (y si es necesario, la sonda) están en todo el género. De hecho, las cepas de virus emergentes o novedosas pueden hacer que los ensayos altamente específicos basados en sondas sean ineficaces. La elección de la detección en tiempo real (teñido frente a sonda) dependerá de la aplicación prevista. Para un laboratorio que lleva a cabo la vigilancia del material cerebral de origen local y espera un alto número de muestras negativas, el uso del tinte intercalante más barato es una opción sensata. El enfoque SYBR Green también sería óptimo al llevar a cabo la vigilancia de escaneo en la que la presencia de lissavirus novedosos o divergentes permanecería sin ser detectada por ensayos basados en sondas más restringidas.
Todos los miembros del género Lyssavirus causan la rabia de la enfermedad, que es mortal una vez que aparecen los síntomas. La gran mayoría de los casos de rabia humana y animal se deben al virus de la rabia (RABV), cuyo reservorio dominante es el perro doméstico10. Los murciélagos son importantes reservorios de host para los lissavirus y todas las especies de lissavirus, excepto dos caracterizadas, se han identificado directamente en murciélagos —Ikoma lyssavirus (IKOV) y el virus Mokola (MOKV)— y de estos dos, se ha especulado que IKOV tiene un reservorio de murciélagos 11. Además de las 16 especies reconocidas de lissavirus12, hay dos lissavirus que se han descrito recientemente: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 y Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Los lissavirus se pueden dividir genéticamente en tres filogrupos, con la mayoría de los lissavirus, incluyendo RABV, pertenecientes al filogrupo I. Sin embargo, los lissavirus más divergentes pertenecen al filogrupo III y es poco probable que sean detectados por RT-PCR diseñados para apuntar a las secuencias de virus RABV o filogrupo I.
El ensayo descrito aquí utiliza el par de imprimación en tiempo real JW12-N165, descrito por primera vez en 20053. Los imprimadores fueron diseñados para ser pan-lyssavirus aunque la aplicación original era como un ensayo TaqMan con sondas para diferenciar especies de lissavirus. La confirmación posterior de que el par de imprimación era pan-lyssavirus en especificidad se logró utilizando un ensayo en tiempo real SYBR de 2 pasos sobre todas las especies de lissavirus disponibles, incluyendo WCBV15. El par de imprimación se describe aquí en un ensayo en tiempo real RT-PCR de un solo paso que utiliza un fluorocromo intercalante, validado utilizando representantes de las 16 especies reconocidas de lissavirus. Este ensayo en tiempo real de un solo paso es un ensayo rápido, sensible y específico del lissavirus y demuestra que la robustez del primer conjunto para identificar incluso especies de lissavirus altamente divergentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Art Barrier pipette tips (various sizes)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra 21R</td>
			<td>Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (mico)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5150</td>
			<td>Equivalent kits can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P or MX3005P real-tme PCR system</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eqivalent machines can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp reaction plate base</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td>Used to hold tube strip and plates securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically clear flat clear strips (8)</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect fit frame (if using tube strips)</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Specific to machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: for primer details see Table 2.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered at 0.05 &#181;mole scale HPLC purified.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast 96 well plares, non skirted</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex machine / Whirlimixer</td>
			<td>Fisons Scientific equipment</td>
			<td>SGP-202-010J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unless stated, alternative equipment can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis

Los ensayos moleculares son rápidos, sensibles y específicos, y se han convertido en fundamentales para el diagnóstico de la rabia. Los ensayos basados en PCR se han utilizado durante décadas para confirmar el diagnóstico de la rabia, pero recientemente han sido aceptados por la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) como método principal para detectar la infección por rabia. Los ensayos RT-PCR en tiempo real proporcionan datos en tiempo real y son sistemas de tubos cerrados, lo que minimiza el riesgo de contaminación durante la configuración. Los ensayos RT-PCR en tiempo real que intercalan el ADN no requieren sondas costosas, minimizando el costo por muestra, y cuando los imprimadores están diseñados en regiones conservadas, ensayos que son específicos entre los géneros de virus en lugar de específicos de un solo virus especies son posibles. Aquí describimos un ensayo RT-PCR en tiempo real SYBR que detecta lissavirus en todo el género Lyssavirus, incluyendo los virus más divergentes IKOV, WCBV y LLEBV. Junto con el análisis de la curva de disociación, este ensayo es sensible y específico, con la ventaja de detectar todas las especies de lissavirus. El ensayo ha sido adoptado en muchos laboratorios de diagnóstico con ambientes de calidad garantizada, lo que permite un diagnóstico robusto, rápido y sensible de casos de rabia animal y humana.

Watch this Scientific Journal Video about Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis at JoVE.com

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

Este RT-PCR en tiempo real que utiliza tinte intercalador dsDNA es adecuado para diagnosticar infecciones por lissavirus. El método comienza con el ARN extraído de la rabia sospechada de muestras ante mortem o post mortem, detallando la preparación de mezclas maestras, la adición de ARN, la configuración de la máquina en tiempo real y la correcta interpretación de los resultados.

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Este RT-PCR en tiempo real es adecuado para diagnosticar rápidamente la rabia en muestras ante mortem y post mortem. Las imprimaciones Pan-Lyssavirus han sido optimizadas para identificar a todos los miembros del género Lyssavirus. Este es un ensayo rápido, sensible y de tubo cerrado que detecta virus de todo el género Lyssavirus, incluyendo especies altamente divergentes de especímenes clínicos.La OIE ha aceptado recientemente ensayos moleculares para denunciar la infección por rabia. Esto es particularmente importante para los especímenes descompuestos que no siempre pueden ser diagnosticados por el cultivo del virus o los métodos de detección de antígenos. Debido a la sensibilidad de este ensayo, una buena práctica de laboratorio, incluida la separación de las diferentes etapas, es vital para minimizar el riesgo de contaminación.Demostrando el procedimiento estará Daisy Jennings, una diagnóstica de mi laboratorio. Comience cuantificando el ARN con un espectrofotómetro de micro volumen. Asegúrese de que la máquina esté ajustada al ARN y utilice una o dos microlitros de agua de grado molecular para normalizar la máquina y establecer una línea de base.Mida la concentración de ARN y ajústela a un microgramo por microlitro. Planifique el diseño de su placa PCR con una hoja de cálculo teniendo en cuenta tanto las muestras de prueba como las de control. Prepare una estación de trabajo PCR desinfectando superficies y, si utiliza un gabinete UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de arrancar.Retire los reactivos y las imprimaciones del congelador para descongelar pero mantenga la mezcla enzimática sobre hielo en todo momento. Mezclar brevemente los reactivos y la centrífuga para recoger el líquido. Preparar mezclas maestras de PCR para Lyssavirus y Beta-Actin de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Deje las mezclas maestras sobre hielo hasta que estén listas para usar. Mezclar y centrifugar las mezclas maestras preparadas y dispensar 19 microlitros en los pozos pertinentes de la placa o tira de tubo compatible con la máquina PCR. En una habitación separada o en un armario UV, agregue cuidadosamente un microlitro del ARN preparado.Si utiliza un armario UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de arrancar. Después de las muestras de prueba, agregue el control positivo y el control sin plantilla. Al agregar el ARN a las mezclas maestras, asegúrese de que se agrega al pozo correcto.Utilice un plan de placas para ayudar a este paso. Selle la placa comprobando que las tapas están planas a través de la placa y gírala hacia abajo para recoger todo el líquido en la parte inferior de los pozos. Asegúrese de que cada pozo tenga el mismo volumen de líquido y que no haya burbujas visibles.A continuación, transfiera las muestras a la máquina PCR. Abra el programa eligiendo SYBR Green con disociación. Seleccione los pozos a analizar eligiendo desconocido como el tipo de muestra y SYBR como el tinte fluorescente.Etiquete los pozos en el diseño de la placa con la información de la muestra, incluyendo si el ensayo es para Lyssavirus L o Beta-Actin. Haga clic en la configuración del perfil térmico y modifique las condiciones de ciclo térmico especificadas en el manuscrito. Haga clic en Inicio y, a continuación, elija una ubicación para guardar el archivo y marque la casilla para apagar la lámpara al final de la ejecución.Cuando aparezca la opción de iniciar antes de calentar la lámpara, haga clic en Ejecutar ahora, pero asegúrese de que la lámpara tenga menos de 15 minutos para calentarse. Cuando se haya completado la ejecución del PCR, proceda con el análisis de datos. Primero, analice las gráficas de amplificación de Lyssavirus.Las muestras positivas muestran rampas exponenciales, mientras que las muestras negativas tienen gráficas de amplificación planas sin valores de TC. A continuación, analice los resultados de la curva de disociación de Lyssavirus de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Una muestra positiva de Lyssavirus tendrá una temperatura de fusión entre 77 y 80 grados Celsius y se solapará con el control positivo.A continuación, analice las gráficas de amplificación beta-actina y las curvas de disociación en comparación con los controles para interpretar el resultado general. Vea el informe de texto y utilice los detalles para registrar los valores CT y TM obtenidos para el ARN de control en una tarjeta de control para confirmar que la ejecución se realizó correctamente y que se pueden notificar los resultados de la muestra de prueba. Este protocolo se utiliza para demostrar la sensibilidad del Pan-Lyssavirus RT-PCR en una serie de dilución de ARN de un virus estándar de control.La curva de amplificación indica que se pueden detectar tan solo 10 picogramos de Lyssavirus y las curvas de disociación verifican la temperatura de fusión del producto. La temperatura de fusión se utiliza para confirmar que el amplicon es específico del lyssavirus. Los resultados aquí muestran un rango de temperatura de fusión en todo el género Lyssavirus de 77.34 a 79.67 grados Celsius.Los valores de temperatura de fusión inferiores a 76,8 o superiores a 80,2 se consideran no específicos. La sensibilidad de este ensayo RT-PCR también se determina mediante la detección de ARN a partir de tres muestras cerebrales positivas de Lyssavirus. Se pueden detectar tan solo 0,1 picogramos por microlitro de ARN objetivo para dos de las tres muestras.En particular, los representantes de todas las especies reconocidas de Lyssavirus se detectan utilizando este ensayo. Si se analizan extractos de ARN a partir de muestras clínicas como saliva o CSF, los resultados de Beta-Actin pueden ser negativos debido a la falta de ácidos nucleicos del huésped. La adición de un control exógeno puede resolver este problema.Se recomienda la secuenciación de muestras positivas de Lyssavirus para proporcionar información adicional sobre los orígenes geográficos y del huésped de una infección por rabia. La manipulación de muestras positivas de Lyssavirus o sospechas positivas debe ser de acuerdo con las pautas locales de salud y seguridad. El ARN extraído no es infeccioso, por lo tanto se puede manejar dentro de laboratorios de baja contención.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Investigación

Inmunología e Infección

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...