Denna realtid RT-PCR är lämplig att snabbt diagnostisera rabies i ante-mortem och post-mortem prover. Pan-Lyssavirusprimer har optimerats för att identifiera alla medlemmar i Lyssavirus släktet. Detta är en snabb, känslig och sluten slang analys som upptäcker virus från hela Lyssavirus släktet inklusive mycket divergerande arter från kliniska exemplar.
OIE har nyligen accepterat molekylära analyser att rapportera rabies infektion. Detta är särskilt viktigt för neddelas exemplar som inte alltid kan diagnostiseras med viruskultur eller metoder för att upptäcka antigen. På grund av känsligheten hos denna analys, god laboratoriesed inklusive separation av de olika stadierna är avgörande för att minimera risken för kontaminering.
Demonstrerar proceduren blir Daisy Jennings, en diagnostiker från mitt laboratorium. Börja med att kvantifiera RNA med en mikrovolymspektrofotometer. Se till att maskinen är inställd på RNA och använd en till två mikroliter av vatten av molekylärt betyg för att normalisera maskinen och upprätta en baslinje.
Mät RNA-koncentration och justera den till ett mikrogram per mikroliter. Planera layouten på din PCR-platta med ett kalkylblad med hänsyn till både test- och kontrollprover. Förbered en PCR-arbetsstation genom att desinficera ytor och om du använder ett UV-skåp, sätt på UV-lampan 10 minuter före start.
Ta bort reagenser och primers från frysen för att tina men håll enzymblandningen på is hela tiden. Blanda reagenserna och centrifugen kort för att samla vätskan. Förbered PCR master mixar för Lyssavirus och Beta-Actin enligt manuskriptet riktningar.
Lämna befälhavaren blandar på is tills klar att använda. Blanda och centrifugera de förberedda mastermixarna och dispensera 19 mikroliter i de relevanta brunnarna i PCR-maskinens kompatibla platta eller rörlist. I ett separat rum eller ett UV-skåp, tillsätt försiktigt en mikroliter av det förberedda RNA.
Om du använder ett UV-skåp ska du sätta på UV-lampan 10 minuter före start. Efter testproven lägger du till den positiva kontrollen och den ingen mallkontroll. När du lägger till RNA till master mixar, se till att det läggs till rätt brunn.
Använd en platta plan för att hjälpa detta steg. Försegla plattan kontrollera att locken är platt över plattan och snurra ner den för att samla all vätska i botten av brunnarna. Se till att varje brunn har samma volym vätska och inga bubblor är synliga.
Överför sedan proverna till PCR-maskinen. Öppna programmet välja SYBR Green med dissociation. Välj de brunnar som ska analyseras välja okända som provtyp och SYBR som fluorescerande färgämne.
Märk brunnarna på plattans layout med provinformationen inklusive om analysen är för Lyssavirus L eller Beta-Actin. Klicka på Termoprofilens inställning och modifiera de termiska cykelförhållandena enligt vad som anges i manuskriptet. Klicka på Start välj sedan en plats för att spara filen och markera rutan för att stänga av lampan i slutet av körningen.
När alternativet att starta innan lampans uppvärmning visas, klicka på kör nu men se till att lampan har mindre än 15 minuter att värma upp. När PCR-körningen har slutförts fortsätter du med dataanalys. Analysera först Lyssavirus-amplifieringstäpporna.
Positiva prover visar exponentiella ramper medan negativa prover har plana förstärkningstomter utan CT-värden. Därefter analysera Lyssavirus dissociation kurvan resultaten av testproverna vid sidan av kontrollprover. Ett Lyssavirus-positivt prov kommer att ha en smälttemperatur mellan 77 och 80 grader Celsius och överlappar med den positiva kontrollen.
Därefter analysera Beta-Actin förstärkning tomter och dissociation kurvor jämföra med kontrollerna för att tolka det övergripande resultatet. Visa textrapporten och använd detaljerna för att registrera de CT- och TM-värden som erhållits för kontroll-RNA i ett kontrollkort för att bekräfta att körningen lyckades och att provresultaten för test kan rapporteras. Detta protokoll används för att påvisa känsligheten hos Pan-Lyssavirus RT-PCR på en RNA-utspädningsserie av ett kontrollstandardvirus.
Förstärkningskurvan indikerar att så lite som 10 pikogram av Lyssavirus kan detekteras och dissociationskurvorna verifierar produktens smälttemperatur. Smälttemperaturen används för att bekräfta att amplicon är Lyssavirus specifik. Resultaten visar här ett smältande temperaturområde över Lyssavirussläktet 77,34 till 79,67 grader Celsius.
Smälttemperaturvärden under 76,8 eller över 80,2 anses vara icke-specifika. Känsligheten hos denna RT-PCR-analys bestäms också genom att detektera RNA från tre Lyssavirus positiva hjärnprover. Så lite som 0,1-piogram per mikroliter av mål-RNA kan detekteras för två av de tre proverna.
Noterbart, representanter från alla erkända Lyssavirus arter upptäcks med hjälp av denna analys. Om analysera RNA-extrakt från kliniska prover som saliv eller CSF, beta-Actin resultat kan vara negativ på grund av brist på värd nukleinsyror. Tillägg av en exogen kontroll kan lösa problemet.
Sekvensering av Lyssavirus positiva prover rekommenderas att ge ytterligare information angående geografiska och värd ursprunget till en rabiesinfektion. Hantering av Lyssavirus positiva eller misstänkta positiva prover måste ske enligt lokala riktlinjer för hälsa och säkerhet. Den extraherade RNA är icke-infektiös, därför kan hanteras inom låg inneslutning laboratorier.
