Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

ويشكر المؤلفون هيذر روشان (المركز الكندي للثقافة الثقافية ، جامعه واترلو لتوفير ثقافة البكتيريا الزرقاء التي درست وسوسن أبو حراخ (جامعه كارلتون) للحصول علي المساعدة التقنية.

1-اعداد الفصل اللوني السائل غير المستهدف (LC)-مجموعات بيانات MS/MS
ملاحظه: يمكن تنفيذ العمليات باستخدام اي مطياف الكتلي عالي الاستبانة وطريقه تحليليه محسنه لفئة مستهدفه من التحاليل. MC الأمثل الحالات LC-MS/MS علي مطياف الشامل اوربراب مدرجه في جدول المواد.
<ol><li>
تحميل ...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

قوات الأمر الذي هو استراتيجية المباشرة إلى الامام والسريع للكشف عن فئات كامله من المركبات, خاصه ذات الصلة لاكتشاف مركب المنتجات الطبيعية. ويتمثل أهم جانب من جوانب الأمر الهام في تحديد معايير تجزئه MS/MS المحددة للفئة المستهدفة من المركبات. في هذا المثال التمثيلي, وقد استخدمت قوات الأمر الذي...

والطيف الكتلي الترادفي (MS/MS) هو أسلوب طيفي للكتلة يستخدم علي نطاق واسع وينطوي علي عزل أيون السلائف والحث علي التجزؤ عن طريق استخدام طاقة التنشيط مثل التفكك المستحث بالاصطدام (CID)1. الطريقة التي تكون فيها شظايا الأيونات مرتبطة ارتباطا وثيقا ببنيتها الجزيئية. وغالبا ما تكون المنتجات الطبيعية بيوسينثيسيزيد كخليط من مركبات مماثله هيكليا بدلا من كماده كيميائية واحده فريدة من نوعها2. وعلي هذا النحو ، فان المركبات ذات الصلة الهيكلية التي تشكل جزءا من نفس الفئة الحيوية غالبا ما تشترك في خصائص تجزئه MS/MS الرئيسية ، بما في ذلك أيونات المنتجات المشتركة و/أو الخسائر المحايدة. القدرة علي فحص العينات المعقدة للمركبات التي تمتلك أيونات المنتجات الخاصة بالفئة و/أو الخسائر المحايدة هي استراتيجية قويه للكشف عن فئات كامله من المركبات ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف المنتجات الطبيعية الجديدة3، 4 , 5 , 6-وعلي مدي عقود ، سمحت أساليب قياس الطيف الكتلي مثل المسح المحايد للخسارة والفحص بالسلائف الايونيه باستخدام أدوات منخفضه الاستبانة بالكشف عن الأيونات التي لها نفس الخسارة المحايدة أو أيونات المنتجات. ومع ذلك ، الأيونات المحددة أو التحولات اللازمة ليتم تعريفها قبل تنفيذ التجارب. ونظرا لان مقاييس الطيف الكتلي العالية الاستبانة أصبحت أكثر شيوعا في مختبرات البحوث ، فان العينات المعقدة تخضع الآن للفحص الشائع باستخدام أساليب الحيازة غير المستهدفة والمعتمدة علي البيانات (DDA). وعلي النقيض من الفقدان المحايد التقليدي والفحص الأيوني للسلائف ، يمكن تحديد المركبات المرتبطة هيكليا بتحليل ما بعد الاقتناء7. في هذا العمل ، ونحن نظهر استراتيجية وضعناها تسمي تصفيه التجزئة التشخيصية (قوات الأمر الأمر)5،6، نهج مستقيم إلى الامام وسهل الاستخدام للكشف عن فئات كامله من المركبات داخل المصفوفات المعقدة. وقد تم تنفيذ هذه الوحدة في قوات الأمر الجديد في منصة مفتوحة المصدر ، MZmine 2 والمتاحة عن طريق تحميل MZmine 2.38 أو أحدث الإصدارات. الأمر الذي يسمح للمستخدمين بفحص مجموعات بيانات DDA بكفاءة لأطياف MS/MS التي تحتوي علي أيونات المنتجات و/أو الخسارة المحايدة التي يتم تشخيصها لفئات كامله من المركبات. الحد من قوات الأمر الذي هو أيونات المنتج المميزة و/أو الخسائر المحايدة لفئة من المركبات يجب ان يحددها المحلل.
علي سبيل المثال ، كل واحد من أكثر من 60 المختلفة فومونوزين فطري المحددة8،9 تمتلك سلسله الجانب tricarballylic ، التي تولد m/z 157.0142 (C6H5س5-) أيون المنتج علي تجزؤ [م-ح]- أيون4. ولذلك ، يمكن الكشف عن جميع والفيومونسنات المفترضة في عينه باستخدام قوات الوضع الخاصة عن طريق فحص جميع أطياف ms/ms داخل مجموعه بيانات DDA التي تحتوي علي البارز m/z 157.0142 المنتج أيون. المثل ، يمكن الكشف عن المركبات الكبريت عن طريق فحص مجموعات بيانات DDA لأطياف MS/MS التي تحتوي علي فقدان محايد تشخيصي 79.9574 Da (SO3)3. وقد تم تطبيق هذا النهج أيضا بنجاح للكشف عن الببتيدات دوري جديد5 والمنتجات الطبيعية التي تحتوي علي بقايا التربتوفان أو فينيلالانين6.
لإظهار فعاليه قوات الأمر الأمر وسهوله استخدامها داخل منصة MZmine10، قمنا بتطبيق هذا النهج علي تحليل الميكرومثانه فئة من أكثر من 240 السموم ذات الصلة هيكليا التي تنتجها سيانوكوبالامين المياه العذبة11,12,13.
والأكثر شيوعا هو السميات المزرقة المبلغ عنها ، مع المتجانس MC-LR (ليوسين [L]/ارجينين [R]) الأكثر كثيرا دراسة (الشكل 1). الطحالب المجهرية الاحاديه غير الريبوميه غير المشبعة بالمكورات العنقودية ، بيوسينثيسيزيد من قبل البكتيريا الزرقاء المتعددة أجناس بما في ذلك microcystis ، انابينا ، nostoc ، و planktothrix12،13. وتتكون من خمسه بقايا مشتركه واثنين من المواقع المتغيرة التي تحتلها الأحماض الامينيه L. ما يقرب من جميع الاشراف علي المخدرات تمتلك السمة β-الأحماض الامينيه 3-الامينيه-9-ميثوكسي-2 ، 6 ، 8-تريميثيل-10-فينيلعشاري-4 ، 6-دايندييك حمض (إدا) بقايا في الموقف 511.  ويرد وصف جيد لمسارات التجزئة ms/ms من الاشراف علي الاشراف14،15؛ بقايا إدا هي المسؤولة عن ms/ms المنتج البارز ، m/z 135.0803 + (C9H11O +) وكذلك أيونات المنتجات الأخرى بما في ذلك m/z 163.1114 + (c11H 15 O +) (الشكل 2). ويمكن فحص مجموعات بيانات DDA غير المستهدفة من مقتطفات Microcystis الزنجاريه الخلوية لجميع المجهريات الموجودة باستخدام هذه الأيونات التشخيصية ، والتي منحت ان الميكرومثانه لديها بقايا إدا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

وغالبا ما تكون المنتجات الطبيعية بيوسينثيسيزيد كخليط من مركبات مماثله هيكليا, بدلا من مركب واحد. نظرا لخصائصها الهيكلية المشتركة ، العديد من المركبات داخل نفس الفئة الخضوع لتجزئه MS/MS مماثله ولها عده أيونات المنتج متطابقة و/أو خسائر محايده. والغرض من تصفيه التجزئة التشخيصية هو الكشف بكفاءة عن جميع مركبات فئة معينه في مقتطف معقد عن طريق فحص مجموعات بيانات LC/ms/ms غير المستهدفة لأطياف MS/ms التي تحتوي علي أيونات منتجات محدده الفئة و/أو خسائر محايده. ويستند هذا الأسلوب علي وحده قوات الأمر التي تنفذ داخل منصة MZmine مفتوحة المصدر التي تتطلب مقتطفات عينه يتم تحليلها عن طريق الحصول علي البيانات التي تعتمد علي مطياف كتله عاليه الاستبانة مثل رباعي اورراب أو رباعي الوقت من الطيران الشامل تحليل. والقيد الرئيسي لهذا النهج هو ان المحلل يجب ان يحدد أولا أيونات المنتجات و/أو الخسائر المحايدة المحددة للفئة المستهدفة من المنتجات الطبيعية. وتسمح قوات التدخل الخاصة بالاكتشاف اللاحق لجميع المنتجات الطبيعية ذات الصلة داخل عينه معقده ، بما في ذلك المركبات الجديدة. في هذا العمل ، ونحن نظهر فعاليه قوات الأمر الذي من خلال فحص مقتطفات من الزنجاريه Microcystis ، وهو الطحالب الضارة البارزة التي تسبب البكتيريا الزرقاء ، لإنتاج ميكروكسينينس.

وتظهر مؤامرة قوات الأمر التي تم إنشاؤها بعد تحليل الزنجاريه CPCC300 في الشكل 4. المحور السينيلهذه المؤامرة هو m/z من أيونات السلائف التي استوفت معايير الأمر المحدد في حين ان المحور صيظهر m/z من جميع أيونات المنتجات داخل أطياف ms/ms. لهذا ال...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

تصفيه التجزئة التشخيصية ، التي تم تنفيذها في MZmine ، هو أسلوب أنيق ، بعد الاستحواذ علي شاشه بيانات LC-MS/MS لفئات كامله من المنتجات الطبيعية المعروفة وغير المعروفة. تقوم هذه الاداه بالبحث في أطياف MS/MS لأيونات المنتج و/أو الخسائر المحايدة التي عرفها المحلل علي انها تشخيص للفئة الكاملة من المركبات.

اكتشاف المنتجات الطبيعية مع تصفيه التجزئة التشخيصية LC-MS/MS: تطبيق لتحليل ميكروسيستن

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

وغالبا ما يتم التركيب الحيوي للمنتجات الطبيعية كفئة من المركبات، وليس كمنتج واحد. تصفية التجزئة التشخيصية هي نهج بسيط للكشف عن جميع المركبات ذات الصلة هيكليا داخل خليط معقد. تصفية التجزئة التشخيصية، التي تنفذ في برنامج MZmine، يسمح المحلل لاستكشاف مجموعات بيانات قياس الطيف الشامل للمنتجات الطبيعية الجديدة التي من شأنها أن تفوت خلاف ذلك.وهذا يشمل المنتجات الحيوية الجديدة، والسموم الجديدة أيضا. ويمكن أن يُسترشد في عمليات تقييم التعرض، وذلك من خلال تصفية التشظي التشخيصية، التي تُطبق على فئات السموم التي تلوث الغذاء والماء. عند تطبيقها على مستخلصات ميكروبية ونباتية ، يمكن أن يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة.يتطلب استخدام تصفية التجزئة التشخيصية فهمًا لخصائص قياس الطيف الكتلي المتناسقة الرئيسية التي تحدد فئة كيميائية. وهذا يعني أن المركبات المماثلة هيكليا سوف تولد أيونات مميزة. اسمي شون هوغستراأنا فني أبحاث ومطور برامج في مركزنا، وسوف أقوم بإظهار الإجراء. لإعداد عينة لتحليل ميكروستين، تلقيح 30 ملليلتر من قارورة البكتيريا الزرقاء العقيمة المتوسطة إلى ما يقرب من خمس مرات-10-إلى-الخمسة الخلايا لكل ملليلتر، في ظل ظروف اتعفن، في 250 ملليلتر قارورة إرلينماير، ورصد كثافة الخلية مع مقياس الهيموسيت. بعد 26 يوما من الثقافة photoautotrophic، مضيئة مع ضوء فلوري أبيض بارد باستخدام نظام 12 ساعة ضوء الظلام في 27 درجة مئوية، مع دوامة مرة واحدة يوميا، واستخدام 47 ملليلتر قطر GF / C الزجاج أوراق تصفية الليفية الدقيقة لفصل الخلايا من وسيلة الثقافة عن طريق الترشيح فراغ.إضافة ثلاثة ملليلتر من 80٪ الميثانول إلى الخلايا المحصودة في أنابيب اختبار 14 ملليلتر، ودوامة و sonicate في وقت لاحق كل أنبوب لمدة 30 ثانية. بعد سونيكيشن، lyse العينات مع ثلاث ساعات متتالية، ناقص-20 درجة مئوية تجميد، و 15 دقيقة دورة ذوبان درجة حرارة الغرفة، وتصفية كل خلية البكتيريا الناتجة استخراج من خلال الفردية 0.22 ميكرومتر بوليتيترافلورو فلاتر الحقن. باستخدام تيار لطيف من غاز النيتروجين، وتجفيف مستخلصات مع المبخر في 30 درجة مئوية، وتخزين مستخلصات الجافة في ناقص 20 درجة مئوية.لتحليل قياس الطيف الكتلي المترادف للكروماتوغرافيا السائلة، إعادة تكوين البقايا المجففة لتحليلها مع 500 ميكرولترات من 90٪ من الميثانول، ودوامة العينات لمدة 30 ثانية. نقل إلى قارورة الكروموغرافيا السائلة عالية الضغط الكهرمان. ثم تحليل استخراج البكتيريا الزرقاء باستخدام طريقة اكتساب تعتمد على البيانات على مطياف كتلة عالية الدقة وفقا للبروتوكولات القياسية.تحتوي معظم الميكروستينات على بقايا ATA تنتج أيونات من المنتجات التشخيصية في قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب، M through Z 135.0803، و 163.1114. بالنسبة لإعداد مجموعة بيانات قياس الطيف الكتلي غير المستهدفة، افتح MZmine 2، وحدد استيراد البيانات الخام"تحت أساليب البيانات الخام" القائمة المنسدلة. ثم حدد ملفات البيانات من تحليل ميكروستين، وحدد عامل تصفية الانتقاء الذروة لتطبيق خوارزمية المركزية الموردة.لتصفية تجزئة التشخيص أو DFF، من ملفات الاكتساب المستندة إلى البيانات المستوردة، استخدم المؤشر لتمييز ملفات البيانات، وفتح القائمة المنسدلة مرئيات "لتحديد الخيار DFF. في مربع الحوار DFF الذي يظهر، أدخل نطاق أوقات الاستبقاء والدقائق عندما يتملّل الفئة المستهدفة من التحليلات، والعثور على نطاق نسبة الشامل إلى الشحنة للفئة المستهدفة من التحليلات، بما في ذلك إمكانية المركبات المشحونة المتعددة عند الاقتضاء. إدخال دقة الكتلة الطيفية الكتلية القابلة للتحقيق من أداة قياس الطيف الكتلي، وإدخال أيونات المنتجات الخاصة بالفئة من نسبة الكتلة إلى الشحنة.أدخل الخسائر المحايدة الخاصة بالفئة، وحدد الحد الأدنى من كثافة أيونات المنتجات التشخيصية و/أو الخسائر المحايدة التي يجب اعتبارها كنسبة مئوية من ذروة قاعدة أطياف الطيف الطيفي الكتلي المرادف. ثم حدد مسار واسم الملف لإخراج النتائج ثم انقر فوق موافق "لبدء تشغيل DFF. سوف تظهر مؤامرة DFF عند الانتهاء بنجاح من الإعداد.يجب على المحلل تفسير الأطياف الكتلية جنبا إلى جنب من المركبات المعروفة داخل فئة المركب لتحديد أيونات المنتج و / أو الخسائر المحايدة التي هي تشخيص لفئة كاملة من المركبات. تم إنشاء هذه المؤامرة DFF بعد تحليل M.aeruginosa CPCC 300. ويمثل المحور س هذه النسبة من الكتلة إلى الشحنة للأيونات السليفة التي تفي بمعايير DFF المحددة، بينما يُظهر المحور ص نسبة الكتلة إلى الشحنة لجميع أيونات المنتج داخل أطياف الطيف الكتلي المترادفة للميكروسينتس.ولهذا التحليل، شملت معايير الكشف عن الميكروستين أيونات السلائف في نسبة الكتلة إلى الشحنة التي تتراوح بين 400 و 200، وأوقات الاستبقاء بين دقيقتين إلى ست دقائق. والأهم من ذلك، احتوت هذه الطيف الطيفي الكتلي المترافق كلا من نسب الكتلة إلى الشحنة فوق عتبة كثافة الذروة الأساسية المحددة البالغة 15٪. ومن بين 4، 116 من أطياف الطيف الكتلي التي تم الحصول عليها أثناء التحليل، استوفت 26 أطيافاً معايير DFF وتم اكتشافها في مستخلص M.aeruginosa CPCC 300.يمكن تعيين microcystins الرئيسية التي تم الكشف عنها بثقة كما ارجينين الميكروستين microcystin وdemethylated حمض الأسبارتيك microcystin لوسيين أرجينين. كما يتم اكتشاف مركبات جديدة باستخدام تصفية التجزئة التشخيصية، يمكن أن تزرع الكائنات الحية على نطاق واسع لعزل وتوصيف المركبات بواسطة NMR. عند تطبيقها على microcystins، تصفية التجزئة التشخيص يسمح لنا لتحديد ما إذا كانت أساليب الفحص التقليدية المستهدفة الكشف عن السموم الرئيسية الموجودة داخل عينة.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR الطيفي كأداة قوية لتقييم السريع من الدهون الملف من السمك ملاحق النفط

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

دمج استخراج الصلبة المرحلة المصغرة و لك-مس / مس الكشف عن 3-نيتروتيروسين في البول البشري للتطبيقات السريرية

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

حرق الضغوط الناجمة عن المتفجرات مستحلب المياه على أساس الحد الأدنى

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

جمع التنفس من الأطفال لاكتشاف العلامات البيولوجية المرض

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

طريقه التحلل اللوني للغاز بخطوتين مع الكشف الطيفي الشامل لتحديد مكونات حبر الوشم والمنتجات المزيفة

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

تطبيق الجهد في الضوء الديناميكي التشتت تحليل حجم الجسيمات

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

توليف Aptamer-PEI-g-PEG الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة المحملة بدوكسوروبيسين لتسليم الأدوية المستهدفة

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

مجهر القوة الذرية جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء كأداة للتحقيق في كيمياء البكتيريا الواحدة

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

تحليل تتبع الجسيمات النانوية للجسيمات النانوية الذهبية في الوسائط مائي من خلال مقارنة بين المختبرات

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

إعداد الجسيمات النانوية لتحليل TOF-SIMS و XPS

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...